Введение
ГЛАВА 1. Закономерности расщепления рнк искусственными рибонуклеазами 9
1.1. Введение 9
1.2. Механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 10
1.3. Чувствительность фосфодиэфирных связей в рнк к гидролизу 15
1.3.1. Факторы, способствующие индукции спонтанного расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 17
1.3.2. Гидролиз олигорибонуклеотидов: влияние последовательности и длины 20
1.3.2.1. Влияние структуры РНК на стабильность фосфодиэфирных связей в коротких синтетических олигонуклеотидах 20
1.3.2.2. Влияние оснований, фланкирующих фосфодиэфирную связь, на ее стабильность 21
1.3.2.3. Стабильность фосфодиэфирных связей в синтетических химерных олигонуклеотидах 24
1.3.3. Влияние функциональных групп гетероциклических оснований на чувствительность фосфодиэфирной связи к расщеплению 28
1.3.4. Стабильность биологически значимых молекул РНК 30
1.3.5. Заключение: Факторы, определяющие чувствительность фосфодиэфирных связей к расщеплению 33
1.4. Расщепление рнк искусственными рибонуклеазами на основе пептидов 34
1.4.1. Природные пептиды, обладающие рибонуклеазной акивностью 36
1.4.2. Синтетически полипептиды, проявляющие рибонуклеазную активность 38
1.4.3. Конъюгаты пептидов с молекулами, обладающими сродством к структуре РНК 40
1.4.3.1. Конъюгаты ферментов и олигонуклеотидов 41
1.4.3.2. Конъюгаты коротких пептидов и интеркаляторов 43
1.4.3.3. Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты, обладающие рибонуклеазной активностью 45
1.5. Заключение 49
ГЛАВА 2. Катализаторы расщепления рнк пептидилолигонуклеотиды и органические соединения, включающие основные аминокислоты 50
2.1. Изучение механизма расщепления рнк искусственными рибонуклеазами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (ablkcm) и лизина (nlm), несущими остатки имидазола 50
2.1.1. Анализ доменной структуры химических рибонуклеаз на основе конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана 50
2.1.2. Сравнение рибонуклеазной активности модельных и базовых рибонуклеаз 52
2.1.3. Механизм расщепления РНК искусственными рибонуклеазами ABLkCm и nLm 56
2.2. Расщепление рнк с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 60
2.2.1. Направленное расщепление рнк конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом 60
2.2.1.1. Исследование взаимодействия конъюгата pejo-16 с тРН^з 62
2.2.1.2. Рибонуклеазная активность пептид-олигонуклеотидных
конъюгатов 68
2.2.1.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению
РНК олигонуклеотид-пептидным конъюгатом 73
2.2.2. Расщепление рнк с помощью конъюгатов пептида [argleu]4-gly-nh2 и олигонуклеотидов со случайной последовательностью 75
2.2.2.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 75
2.2.2.2. РНК субстраты 76
2.2.2.3. Определение уровня рибонуклеазной активности и специфичности расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 76
2.2.2.3.1. Расщепление синтетического олигорибонуклеотида олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4 и рер-7 78
2.2.2.3.2. Расщепление in vitro транскрипта тРН^з человека олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 79
2.2.2.3.3. Определение специфичности расщепления HIV-1 РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 82
конъюгатами рер-4 и рер-7 86
2.2.2.3.5. Влияние структуры РНК на специфичность гидролиза 87
2.2.2.4. Контроли специфичности 91
2.2.2.5. Исследование возможности комплементарных взаимодействий между РНК и олигонуклеотидами в составе конъюгатов 91
2.2.2.6. Определение кинетических параметров расщепления РНК
олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 94
2.2.2.6.1. Концентрационные зависимости расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 95
2.2.2.6.2. Кинетика расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 97
2.2.2.6.2.1. Анализ кинетики расщепления олигорибонуклеотида 5-UUCAUGUAAA-3 97
2.2.2.6.2.2. Анализ кинетики расщепления природных РНК-субстратов 100
2.2.2.6.3. Определение сродства олигонуклеотид-пептидных конъюгатов к РНК 106
2.2.2.7. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК 107
2.2.2.8. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на эффективность и специфичность гидролиза 109
2.2.2.9. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 110
2.2.2.9.1. Влияние ионов магния на специфичность и эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 110
2.2.2.9.2. Влияние ионов одновалентных металлов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 113
2.2.2.9.3. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 118
2.2.2.9.4. Влияние денатурирующих агентов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 119
2.2.2.9.5. Влияние ионных и неионных детергентов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 120
2.2.2.10. Механизм расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами по GpX- и РугА-последовательностям 121
2.2.2.10.1. Природа специфичности олигонуклеотид-пептидных конъюгатов к последовательности 121
2.2.2.10.2. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК 123
Заключение 124
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 126
3.1. Материалы 126
3.1.1. Реактивы и препараты 126
3.1.2. Плазмиды 127
3.1.3. Буферы и растворы, использованные в работе 128 3.2. МЕТОДЫ 129 3.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 129 3.2.2.Электрофорез в агарозном геле 129
3.2.3. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях 129
3.2.4. Приготовление растворов искусственных рибонуклеаз серии ABLkCm 129
3.2.5. Линеаризация плазмид pHtk(wt), pHIV и dYF90 130
3.2.6. Получение in vitro транскриптов РНК HIV-1 (фрагмент длиной 96 нуклеотидов), TPHKLys3 человека и тРНКРҐІе из дрожжей 130
3.2.7. Введение [32Р]-метки поЗ-ОН группе тРНК 131
3.2.8. Введение [32Р]-метки в 5-концевое положение РНК 131
3.2.9. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях 132
3.2.10. Расщепление РНК с помощью химических рибонуклеаз серии ABLkCm 132
3.2.11. Расщепление динуклеозидмонофосфата СрА искусственными рибонуклеазами серии ABLkCm, 2L2 и РНКазой А 133
3.2.12. Расщепление РНК с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 133
3.2.13. Исследование связывания in vitro транскрипта TPHKLys3 с конъюгатом рер-16 и олигонуклеотидом 16 134
3.2.14. Пробинг структуры тРНК1у53в присутствии олигонуклеотида 16 или олигонуклеотид-пептидных конъюгатов рер-4 и рер-7 с помощью РНКазы Т1 134
3.2.15. Пробинг структуры TPHKLVS3B комплексе с олигонуклеотидом 16 с помощью РНКазы Н 134
3.2.16. Исследование влияния концентрации солей на гидролитическую активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 135
3.2.17. Исследование влияния температуры на гидролитическую активность олигонуклеотид-пептидного конъюгата 135
3.2.18. Определение Км и Vmax 135
3.2.19. Определение оборотов реакции 136
Выводы 137
Список литературы 139
