Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Пепициллинацнлаза из E.coli 8
1.1.1 Общие свойства 8
1.1.2 Структура активного центра пенициллинацилазы 9
1.1.3 Механизм действия 12
1.2 Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков 17
1.2.1 Основные подходы 17
1.2.1.1 Термодинамически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков 17
1.2.1.2 Кинетически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков 19
1.2.2 Кинетические закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил 20
1.2.3 Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных (раствор/осадок реагентов) водных системах 24
1.3 Факторы оптимизация синтеза р-лактамных антибиотиков 30
1.3.1 Эволюция кинетической схемы ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков 30
1.3.2 Влияние ионной силы на ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков 33
1.3.3 рН-зависимость эффективности биокаталитических процессов, катализируемых ПА 38
1.3.4 Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков 42
2. Экспериментальная часть 46
2.1 Материалы 46
2.2 Методы 46
2.2.1 Определение констант специфичности (ккат I Ки ) гидролиза антибиотиков и доноров ацильной части 46
2.2.2 Количественная характеристика связывания нуклеофила в активном центре ПА 47
2.2.3 Количественная характеристика связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом 47
2.2.4 Анализ влияния добавленного нуклеофила на реакцию гидролиза ампициллина 48
2.2.5 Изучение растворимости компонентов реакции 48
2.2.6 Создание кинетически пересыщенных водных систем в реакциях ферментативного синтеза р-л актам ных антибиотиков 49
2.2.7 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина 49
2.2.8 Изучение нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина в присутствии неорганических солей 50
2.2.9 Изучение реакций ферментативного синтеза ампициллина, амоксициллина и цефалексина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения 50
2.2.10 Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 51
2.2.11 Математическая обработка результатов и моделирование реакций 51
3. Результаты и их обсуждение 52
3,1 Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза р-лактамных антибиотиков 52
3.2 Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацилыюй группы на нуклеофил 56
3.2.1 Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил 56
3.2.2 Изучение влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию 72
3.3 Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах 80
3.3.1 Эффект кинетического пересыщения 80
3.3.2 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в высококонцентрированных водных системах 83
3.3.3 Влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК 86
3.3.4 Изучение зависимости нуклеофильности 6-АПК от концентрации анионов 88
3.3.5 Влияние неорганических солей на скорости синтеза и гидролиза при катализируемом ПА переносе ацильной группы на 6-АПК 90
3.3.6 Связывание аниона вблизи активного центра ПА 91
3.3.7 Изучение влияния природы аниона на нуклеофильность 6-АПК 96
3.3.8 Разработка и применение модели ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков 97
3.4 Катализируемый ПА синтез р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах 103
3.4.1 Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и амоксициллина с использованием эффекта кинетического пересыщения 103
Основные результаты и выводы 111
