Введение
1 Вирус гепатита В и вакцинация 17
1.1 Динамика эпидемического процесса гепатита В в условиях широкомасштабной вакцинации 17
1.2 Генотипы и субтипы HBV и их географическая распространенность 19
1.3 Гуморальный иммунный ответ при гепатите В 20
1.4 Проблема соответствия вакцин эндемичным вариантам HBV 22
1.5 Мутанты вакцинального ускользания и их распространенность 24
2 Морфологические и структурные особенности вируса гепатита В 28
2.1 Морфологические и структурные особенности HBV 28
2.2 Структурные особенности мутанта G145R HBV 30
3 Инфекция HBV и клеточный иммунитет 31
3.1 Система врожденного иммунитета в борьбе с HBV 31
3.1.1 Контроль инфекции вируса гепатита В системой врожденного иммунитета 31
3.1.2 Дисфункция NK-клеток и NKT-клеток 36
3.1.3 Инактивация функций дендритных клеток 37
3.1.4 Вирусная апоптотическая мимикрия 40
3.2 Система адаптивного иммунного ответа в борьбе с HBV 42
3.2.1 Изоляция в клетках и тканях организма как один из механизмов ускользания от Т-клеточного надзора 43
3.2.2 HBV-специфичная CD8+ Т-клеточная дисфункция 44
3.2.3 Ускользание HBV от распознавания CD8+ Т-клетками 47
4 Существующие вакцины против гепатита В и перспективные разработки 48
4.1 Лицензированные вакцины 48
4.1.1 Вакцины «первого» и «второго» поколения 49
4.1.2 Вакцины «третьего поколения» 51
4.2 Перспективные разработки вакцин против гепатита В 53
4.2.1 Применение новых адъювантов 53
4.2.2 Вакцины на основе HBcAg и HBsAg 54
4.2.3 Вакцины против мутантов вакцинального ускользания 56
Материалы и методы 58
5 Материалы 58
5.1 Клинический материал 58
5.1.1 Группы пациентов и сыворотки крови 58
5.1.2 Лейкотромбомасса от здоровых доноров 59
5.2 Коммерческие тест-системы 59
5.1 HBsAg дикого и мутантного типов 60
5.1.1 Природные HBsAg 60
5.1.2 Рекомбинантные HBsAg 60
5.2 Антитела 61
5.2.1 Моноклональные и поликлональные анти-HBsAg антитела 61
5.2.2 Моноклональные антитела для проточной цитометрии 61
6 Методы исследования 62
6.1 Выявление эскейп-мутантов HBV в сыворотках крови человека методом иммуноферментного анализа 62
6.2 Метод серологического портретирования 65
6.3 Полногеномное глубокое секвенирование изолятов HBV 66
6.3.1 Амплификация ДНК и приготовление геномных библиотек 66
6.3.2 Секвенирование NGS 67
6.3.3 Генетический и филогенетический анализ 6.4 Получение очищенного HBV дикого типа и мутантных форм вируса 67
6.5 Микроскопические методы исследования 68
6.5.1 Метод трансмиссионной электронной микроскопии 68
6.5.2 Метод негативного контрастирования 68
6.5.3 Реакция непрямого иммуномечения 69
6.6 Иммунизация 69
6.6.1 Иммунизация мышей 69
6.6.2 Иммунизация овец 71
6.7 Характеристика спектра HBsAg–специфичных антител у иммунизированных животных 72
6.7.1 Скрининговый сэндвич-ИФА для определения спектра HBsAg–специфичных мышиных и овечьих антител 72
6.7.2 Выявление титра антител к различным вариантам HBsAg в мышиных сыворотках методом сэндвич-ИФА 74
6.8 Проточная цитометрия 75
6.8.1 Иммунофенотипирование мононуклеаров периферической крови доноров 75
6.8.2 Стимуляция PBMC с помощью рекомбинантных HBsAg 77
6.8.3 Оценка экспрессии маркеров активации мононуклеаров периферической крови доноров после антигенной стимуляции 77
6.9 Статистические методы 81
7 Результаты 82
7.1 Серологическая характеристика сывороток крови хронических HBsAg-носителей и онкогематологических больных с инфекцией HBV 82
7.1.1 Общая характеристика образцов 82
7.1.2 Серологический поиск эскейп-мутантов HBV 83
7.2 Генетические исследования изолятов HBV 84
7.2.1 Полногеномное глубокое секвенирование изолятов HBV 85
7.2.2 Проведение филогенетического анализа 86
7.2.3 Определение субтипов HBV 87
7.2.4 Анализ мутаций в S-HBsAg 88
7.3 Серологическое портретирование различных вариантов HBsAg 90
7.4 Исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии с применением иммуномечения морфологии природного G145R мутанта и отобранного рекомбинантного HBsAg 94
7.4.1 Исследование ультраструктуры и морфологических особенностей природных HBV дикого типа и мутантов с заменами G145R и S143L 94
7.4.2 Исследование морфологических особенностей рекомбинантных HBsAg с мутацией G145R, полученных в разных технологических условиях 98
7.5 Сравнительное исследование иммуногенных свойств рекомбинантного HBsAg дикого типа и HBsAg с мутацией G145R в условиях in vitro 100
7.5.1 Иммунофенотипирование PBMC здоровых доноров 100
7.5.2 Оценка экспресси маркеров активации на PBMC здоровых доноров после их стимуляции рекомбинантными HBsAg в условиях in vitro 101
7.5.3 Исследование цитокинового профиля PBMC здоровых доноров после их стимуляции рекомбинантными HBsAg в условиях in vitro 105
7.6 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo 112
7.6.1 Разработка иммуноферментных тест-систем для оценки специфичности антител к различным вариантам HBsAg в сыворотках иммунизированных животных 113
7.6.2 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на мышах 117
7.6.3 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на овцах 122
Обсуждение 126
Выводы 139
Список литературы 141
