Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура иммуноглобулинов и их генов 11
1.1.1 Структура антител 11
1.1.2 Гены иммуноглобулинов 14
1.1.3 Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов 16
1.2 Получение фрагментов антител человека с помощью фагового дисплея 17
1.2.1 Фаговый дисплей 18
1.2.1.1 Фрагменты антител, используемые для фагового дисплея 19
1.2.1.2. Фаги, используемые для дисплея фрагментов антител 19
1.2.2 Комбинаторные библиотеки антител человека 25
1.2.2.1 Конструирование наивных библиотек..., 27
1.2.2.2 Конструирование синтетических библиотек 31
1.2.2.3. Конструирование иммунных библиотек * 37
1.2 J Заключение к п. 1.2 42
1.3 Ортопокс вирусы 42
1.3.1 Иммунный ответ при ортопоксвнрусной инфекции 43
1.3.1.1 Клеточный иммунный ответ 43
1.1.2 Гуморальный иммунный ответ 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1 Реактивы и материалы 49
2.1.1 Реактивы 49
2.1.2 Растворы 50
2.1.3 Ферменты 50
2.1.4. Культуральные среды 50
2.1.5. Эукариотическис клетки, бактерии и бактериофаги 51
2.1.6. Вирусы 51
2.1.7. Используемые олиго ну клеотиды 51
2.2 Методы
2.2.1 Выделение периферических лимфоцитов из крови доноров 53
2.2.2 Выделение суммарной РНК из лимфоцитов периферической кров и..53
2.2.3 Синтез кДНК 53
2.2.4 Амплификация VH- и VL-генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов 54
2.2.5 Конструирование линкера и объединение его VH- и VL-гснами в ДНК-последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела человека 54
2.2.6 Встраивание scFv-гснов в векторную фагмиду pHEN2 56
2.2.7 Приготовление компетентных клеток TG1 57
2.2.8 Электропорация 57
2.2.9 Амплификация библиотеки 57
2.2.10 Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами 58
2.2.11 Выделение фаговых одноцепочечных антител 59
2.2.12 Дот-блот анализ на нптроцеллюлозиых фильтрах 59
2.2.13 Иммунофермептный анализ 60
2.2.14 Выделение фагмидной ДНК методом щелочного лизиса 60
2.2.15 ПДРФ-аиализ отобранных scFv 61
2.2.16. Трансформация клеток Е. соїі фагмидной ДНК 61
2.2.17 Анализ экспрессии scFv AT в растворимой форме отдельными клонами библиотеки 61
2.2.18 Электрофорстический анализ белков 62
2.2.1? Вестерн-блот анализ 62
2.2.20 исследование вируснейтрализующей активности фаговых антител 62
2.2.21 Методика очистки одн оцеп очечных антител в растворимой форме на Ni-NTA сорбенте 63
2.2.22 Определение констант аффинности одноцепочечных антител 63
2.2.23. Очистка ортопоксвирусных препаратов 65
2.2.24 Выделение ДНК вируса оспы коров 65
2.2.25 Получение гибридного рекомбинантного белка prJ3L ВОК с использованием экспрсссирующего вектора pUR291 66
2.2.26 Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов 66
ГЛАВА 3. Результаты 68
3.1 Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки scFv AT человека против ортопоксвиру сов 68
3.1.1 Тестирование способности антител сывороток иммунных доноров связывать ВОВ 68
3.1.2 Конструирование комбинаторной иммунной библиотеки scFv AT человека 70
3.1.3 Оценка функционального размера библиотеки 72
3.2 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих
scFv AT, специфичных к белку ргАЗОЬ, и исследование их свойств 74
3.2.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, продуцирующими scFv AT, специфичные к белку ргАЗОЬ 74
3.2.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против белка ргАЗОЬ 75
3.2.3 Отбор из обогащенной комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих scFv AT, специфичные к ргАЗОЬ 76
3.2.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых анти- ргАЗОЬ антител 79
3.2.5 Исследование свойств вируснейтрализующих фаговых анти-ргАЗОЬ антител 80
3.2.6 Определение аминокислотной последовательности вируснейтрализующих scFv AT, специфичных к белку ргАЗОЬ 81
3.3 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих scFv AT, специфичных к ВОК, и исследование их свойств 82
3.3.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, продуцирующими scFv AT, специфичные к ВОК 82
3.3.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против ВОК 84
3.3.3 Отбор из обогащенной против ВОК комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих scFv AT, специфичные к ВОК 85
3.3.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых антител, продуцируемых отобранными против ргАЗОЬ и ВОК клонами 86
3.3.5 Исследование свойств отобранных анти-ВОК антител 88
3.3.6 Определение аминокислотной последовательности scFv AT, специфичных к ВОК 88
3.3.7 Получение растворимых scFv AT 95
3.3.8 Определение константы аффинности растворимого scFv AT Ь9 96
3.4 Определение белка мишени для вируснейтрализующих scFv AT,
специфичных к ВОК 97
3.4.1 Получение штамма E.coli, продуцирующего рекомбкнантный белок prJ3L ВОК (штамм Гришак) 97
3.4.2 Исследование способности фаговых антител, нейтрализующих ВОК, связывать prJ3L 100
Глава 4. Обсуждение результатов 102
Конструирование и характеризация библиотеки 102
Отбор антител против рекомбинантного белка prA30L 104
Отбор антител против ВОК 107
Оценка аффинности отобранных вируснейтрализующих scFv антител 112
Определение белка мишени для вируснейтрализующих анти-ВОК scFv ATI 13
Выводы 117
Список литературы 118
