Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика аденовирусов 13
1.2. Структурные белки капсида Ад 16
1.2.1. Гексон 16
1.2.2. Основание пентона 17
1.2.3. Шип 17
1.2.4. Белок pIX 23
1.3. Инфекционный цикл Ад 24
1.3.1. Проникновение Ад в клетки 24
1.3.2. Дезинтеграция вириона 26
1.3.3. Экспрессия генов и репликация ДНК 26
1.3.4. Сборка вирусных частиц и выход их из клетки 28
1.4. Рецепторы, используемые Ад для проникновения в клетки 30
1.4.1. Первичные рецепторы 30
1.4.2. Вторичные рецепторы 34
1.5. Стратегии таргетинга 36
1.6. Трансдукционный таргетинг 37
1.6.1. Нацеливание Ад с помощью комплексов "адаптер-лиганд" 39
1.6.2. Генетическая модификация тропизма Ад 47
1.6.2.1. Таргетинг Ад с помощью замещения шипов или ГД шипов 48
1.6.2.2. Таргетинг Ад с помощью генетического включения лиганда в капсидные белки 51
1.6.2.2.1. Модификация основания пентона 52
1.6.2.2.2. Модификация гексона 54
1.6.2.2.3. Модификация белка pIX 55
1.6.2.2.4. Модификация ГД шипа 56
1.6.2.2.4.1. Встраивание лигандов на С-конец ГД шипа 56
1.6.2.2.4.2. Встраивание лигандов в ш-петлюшипа 58
1.6.2.3. Замена шипа химерным белком 62
1.6.3. Клеточные линии для получения нацеленных векторов 64
1.7. Аденовирусные векторы как терапевтические агенты 66
Глава 2. Материалы и методы 70
2.1. Материалы 70
2.1.1. Бактериальные штаммы 70
2.1.2. Эукариотические клетки 70
2.1.3. Антитела и белки 71
2.1.4. Реактивы 73
2.2. Молекулярно-биологические методы 73
2.2.1. Методы, используемые в молекулярном клонировании 73
2.2.2. Получение рекомбинантных плазмид 74
2.2.3. Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальных клетках и их очистка 82
2.2.4. Экспрессия белка FF/CD40L в эукариотических клетках 83
2.2.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Иммуноблоттинг 84
2.2.6. Иммуносорбционный ферментный анализ 84
2.2.7. Проточная цитофлюориметрия 85
2.3. Методы, используемые при работе с аденовирусами 85
2.3.1. Гомологичная рекомбинация ъЕ.соИ 85
2.3.2. Трансфекция 86
2.3.3. Наработка вирусов 86
2.3.4. Определение физического и инфекционного титров Ад 87
2.3.5. Выделение ДНК из вирионов 88
2.3.6. Трансдукция клеток Ад векторами 88
2.3.7. Определение кинетики развития вирусной инфекции 89
2.3.8. Радиомечение белков 358-метионином 89
2.3.9. Мечение вирусов [метил-3Н] тимидином 90
2.3.10. Связывание меченых 3Н-тимидином Ад с клетками 90
2.3.11. Выделение нерастворимых белков из клеток инфицированных Ад...91
Глава 3. Результаты 92
3.1. Получение нацеленных аденовирусов с полипептидными лигандами, встроенными вШ-петлю ГД шипа 92
3.1.1. Получение вирусов с удлинёнными Ш-петлями и подтверждение их структуры 92
3.1.2. Сравнение продуктивности и инфекционности вирусов с модифицированными шипами 93
3.1.3. Изучение механизмов проникновения вирусов Ad5Luc.NNRGD в клетки 96
3.1.4. Получение шаттл-векторов, позволяющих встраивать полипептидные лиганды в удлинённые Ш-петли 98
3.1.5. Характеризация вирусов со встройкой полипептида V1P в модифицированные шипы 100
3.2. Разработка стратегии таргетинга Ад векторов, основанной на замещении ГД шипа 105
3.2.1. Конструирование и характеризация химерного белка FF/6H 105
3.2.2. Получение аденовируса с химерным шипом FF/6H 109
3.2.3. Определение механизма, обеспечивающего связывание Ad5LucFF/6H с клетками 113
3.2.4. Развитие инфекции в клетках, инфицированных Ad5LucFF/6H 118
3.2.5. Выбор CD40L в качестве нацеливающего вирус лиганда 124
3.2.6. Получение химеры шип-фибритин, содержащей CD40L 126
3.2.7. Получение и характеризация аденовируса, несущего химерный шип FF/CD40L 128
3.2.8. Включение дополнительного шипа в вирионы, несущие химерный umnFF/CD40L 133
3.2.9. Нацеливание СВ40Ь-содержащих вирусов к дендритным и раковым клеткам 136
Глава 4. Обсуждение результатов 140
Выводы 153
Список использованной литературы 154
