Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Разнообразие азотфиксирующих микробно-растительных симбиозов в природе 12
1.1.1. Общие положения 12
1.1.2. Эндосимбиозы 14
1.1.3. Эктосимбиозы 16
1.2. Сходства и различия бобово-ризобиального и актиноризного симбиозов 18
1.2.1. Инфекционный процесс и клубенекобразование 18
1.2.2. Гены симбиотической азотфиксации и их регуляция 24
1.2.3. Специфичность симбиоза 27
1.3. Роль лектинов в азотфиксирующем симбиозе 30
1.3.1. Общая характеристика лектинов растений 30
1.3.2. Лектины бобовых растений 31
1.3.3. Функции лектинов в азотфиксирующем симбиозе 34
1.4. «Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях 36
1.5. Биоинженерия симбиотических систем 39
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 45
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР генов лектинов 46
2.3. Реактивы и материалы 47
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов 48
2.5. Методы исследований 49
2.5.1. Выделение и очистка ДНК растений 49
2.5.2. Выделение и очистка РНК растений 50
2.5.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 51
2.5.4. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 53
2.5.5. Подготовка компетентных клеток E.coli 54
2.5.6. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК 55
2.5.7. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом 55
2.5.8. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей . 56
2.5.9. Синтез кДНК 56
2.5.10. Полимеразная цепная реакция 57
2.5.11. Клонирование генов лектинов бобовых растений в вектор pCAMBIA 1305.1 58
2.5.12. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium sp 60
2.5.13. Электропорация клеток Agrobacterium sp 60
2.5.14. Получение композитных растений 61
2.5.15. Анализ (3-глюкоуронидазной (gus) активности 63
2.5.16. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака 63
2.5.17. Обработка «бородатых корней» на люцерне, астрагале и облепихе микросимбионтами 65
2.5.18 Обработка «бородатых корней» микросимбионтами на рапсе и табаке 66
2.5.19. Идентификация клубенекобразующего штамма 67
2.5.20. Микроскопирование клубеньков, образованных на «бородатых корнях» облепихи 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1. Клонирование химерных конструкций гена лектина в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1 70
3.2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений 72
3.2.1 .Получение «бородатых корней» на люцерне посевной 72
3.2.2. Получение «бородатых корней» на астрагале нутовом 74
3.2.3. Получение «бородатых корней» на облепихе крушиновидной 75
3.2.4. Получение «бородатых корней» на рапсе 76
3.2.5. Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака 77
3.2.6. Получение композитных растений 78
3.3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков 81
3.3.1. Эксперименты над композитными растениями люцерны 83
3.3.2. Эксперименты над композитными растениями астрагала с PSL 90
3.3.3. Эксперименты над композитными растениями облепихи... 91
3.3.4. Эксперименты над композитными растениями рапса и «бородатыми корнями», полученными на листовых пластинках табака 96
3.4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений 101
3.4.1. Создание полностью трансгенных по гену лектина PSL растений табака 102
3.4.2. Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней» 103
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
