Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
I. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов 8
1. Методы определения первичной структуры пептидов 10
1.1. Методы классической биохимии
Деградация по Эдману
Методы генной инженерии
1.2. Методы масс-спектрометрии
1.3. Комбинированный метод - леддерное секвенирование 14
2. De novo секвенирование пептидов методами тандемной масс-спектрометрии положительных ионов 16
2.1. Диссоциация, активированная соударением (ДАС) 17
2.2. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ) 22
2.3. Использование МАЛДИ для секвенирования пептидов 26
2.4. Фотоактивация диссоциации 29
3. Основные ограничения масс-спектрометрии положительных ионов при секвенировании пептидов и пути их устранения 31
3.1. Изобарные аминокислоты
Лизин и глутамин
Фенилаланин и окисленный метионин 36
3.2. Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин 38
3.3. Пептиды, содержащие дисульфидную связь 41
Химические методы 41
Методы масс-спектрометрии 46
4. Использование масс-спектрометрии отрицательных ионов для секвенирования пептидов 50
II. Пептиды из кожи амфибий рода Rana 56
1. Общие сведения 56
2. Нейропептиды 57
3. Антибактериальные пептиды 58
4. Пептидное профилирование: значение в систематике и эволюции 66
Глава 2. Обсуждение результатов 68
I. Получение исходного биоматериала 68
II. Общая схема масс-спектрометрического секвенирования 68
III. Установление общего пептидного профиля 72
1. Оптимизация ВЭЖХ-разделения
2. Оптимизация эксперимента МАЛДИ
IV. Результаты МС - секвенирования пептидов при электрораспылении в режиме отрицательных ионов 84
V. Результаты масс-спектрометрического секвенирования при электрораспылении в режиме положительных ионов 86
1. Результаты МС-секвенирования пептидов, полученные прямым распылением образцов в источник ионов 86
1.1. Недериватизованные (исходные) пептиды 86
1.2. Дериватизованные дисульфидсодержащие пептиды 89
2. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов, полученные с применением ВЭЖХ-МС/МС (LTQ-FT) 96
2.1. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ) 99
VI. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов с использованием МАЛДИ 101
VII. Детализация пептидного профиля R.ridibunda 111
VIII. Детализация пептидного профиля R.arvalis 114
IX. Сравнительное масс-спектрометрическое изучение пептидных профилей R.ridibunda, обитающих в различных климатических условиях 116
Проверка биологической активности ряда новых пептидов, выделенных из кожи R.ridibunda и R.arvalis 119
Глава 3. Экспериментальная часть 121
Выводы 127
Список литературы 129
