Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами 10
1.1. Фосфонаты - фосфорорганические соединения с С-Р связью 10
1.1.1. Природные и синтетические фосфонаты 11
1.1.2. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов 14
1.1.3. Ферменты, разлагающие фосфонаты с активированной С-Р связью 16
1.2. Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью 22
1.2.1. С-Р лиаза, разлагающая С-Р связь алкилфосфонатов 22
1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы алкилфосфонатов 24
1.3. Физиологическая и генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов 26
1.3.1. Физиологическая регляция разложения алкилфосфонатов...26
1.3.2. Генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов со стороны Pho регулона 29
1.3.3. Гены, кодирующие разложение алкилфосфонатов 32
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1.Бактериальные штаммы и плазмиды 38
2.2. Условия культивирования 39
2.3. Методы работы с ДНК 40
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 40
2.3.2. Получение компетентных клеток 41
2.3.3. Среды и буферы 41
2.4. Субклеточное фракционирование 42
2.5. Аналитические методы 43
2.5.1. Анализ разложения Pn 43
2.5.2. Определение активности щелочной фосфатазы 44
2.5.3. Определение фосфолипидного состава мембран 45
2.5.4. Электрофорез белков 46
2.5.5. Определение концентрации белка 47
2.5.6. Определение ортофосфата 47
2.5.7. Определение общего фосфора 47
2.6. Облучение клеток УФ 48
2.7. Электронная микроскопия тонких срезов 48
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 50
3.1. Разложение метилфосфоната различными штаммами Е. coli 50
3.2. Адаптация клеток Е. coli к Рп 52
3.2.1. Влияние Рп на адаптацию 52
3.2.2. Влияние температуры на адаптацию к Рп 56
3.3. Селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп 57
3.3.1. Гетерогенность популяции и селекция адаптированных клеток 57
3.3.2. Разложение Рп адаптированными клетками 58
3.3.3. Физиологическая, биохимическая и морфологическая характеристики адаптированных клеток 65
3.4. Физиологические и биохимические факторы, влияющие на разложение Рп различными штаммами Е. coli 70
3.4.1. Влияние аэрации на разложение Рп 70
3.4.2. Влияние рН среды на разложение Рп 72
3.4.3. Влияние концентрация Рп на разложение Рп 73
3.4.4. Влияние возраста культуры на разложение Рп 74
3.4.5. Влияние концентрации клеток на разложение Рп 76
3.4.6. Влияние УФ облучения на разложение Рп 78
3.4.7. Влияние проницаемости мембран на разложение Рп 80
3.5. Разложение Рп рекомбинантными штаммами Е. coli 80
3.6. Выявление белков С-Р лиазного комплекса (продуктов phnGHIJKLMNOP генов) и их локализация в клетке 82
Выводы 87
Список литературы 88
