Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами 7
2.1. Введение 7
2.2. Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с субстратом 8
2.3. Аспартильные протеазы 9
2.4. Металлопротеазы 12
2.5. Цистеиновые протеазы 18
2.6. Сериновые протеазы 25
2.7. Заключение 39
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
3.1. Реактивы и материалы 42
3.2. Общие методы 42
3.3. Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках В. subtilis 45
3.4. Получение нативного фермента (BIGEP-Bs) из клеток Bacillus subtilis 46
3.5. Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках Е. coli 47
3.6. Очистка рекомбинантного пропептида BIGEP (HP) 48
3.7. Очистка рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2,
N-3) 48
3.8. Ренатурация и активация рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2, N-3) 49
3.9. Электронная микроскопия 49
3.10. Получение пропептида BIGEP слитого с целлюлозосвязывающим доменом CelD целлюлазы Anaerocellum thermophilum (CBD-P) 49
3.11. Ренатурация зрелых частей BIGEP рекомбинантым пропептидом in trans 50
3.12. Обработка BIGEP аминопептидазами 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
4.1. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника 52
4.2. Изучение созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 55
4.2.1. Влияние природы (-1) остатка на созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 4.2.2. Эффект делеции З-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного белка клетками Bacillus subtilis 58
4.2.3. Созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius in vitro 61
4.2.4. Автоактивация глутамилэндопептидазы В. intermedius 65
4.3. Изучение роли N-концевого остатка в функционировании зрелой глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 67
4.3.1. Получение вариантов глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius без N-концевых остатков 67
4.3.2. Исследование созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с собственным пропентидом в системе in trans 69
4.3.3. Получение глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с тремя удаленными N-концевыми остатками 71
4.4. Заключение 74
5. ВЫВОДЫ 75
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 76
