ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................ 5
Актуальность исследования.......................................................................... 5
Степень разработанности темы диссертации.............................................. 6
Цель диссертационного исследования......................................................... 6
Научная новизна............................................................................................. 7
Теоретическая и практическая значимость работы.................................... 7
Методология и методы исследования.......................................................... 8
Положения, выносимые на защиту .............................................................. 8
Степень достоверности и апробация результатов ...................................... 9
Личный вклад автора ..................................................................................... 9
Структура и объём диссертации................................................................... 9
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................ 10
1.1 Молекулярные механизмы лекарственной устойчивости..................... 10
1.1.1 Транспорт лекарств через плазматическую мембрану ................... 11
1.1.2 Инактивация противоопухолевого соединения ............................... 13
1.1.3 Ингибирование апоптоза.................................................................... 14
1.1.4 Гетерогенность опухоли..................................................................... 15
1.1.5 Репарация ДНК.................................................................................... 15
1.2 Механизмы гибели клеток........................................................................ 16
1.2.1 Апоптоз ................................................................................................ 16
1.2.2 Некроз................................................................................................... 17
1.2.3 Некроптоз............................................................................................. 19
1.2.4 Ферроптоз............................................................................................. 19
1.2.5 Купроптоз............................................................................................. 20
1.3 Активные формы кислорода в норме и патологии ................................ 21
1.3.1 Оксидативная терапия ........................................................................ 23
1.4 Применение медьсодержащих соединений в противоопухолевой
терапии........................................................................................................................ 24
1.4.1 Биологические свойства меди............................................................ 24
1.4.2 Препараты-модуляторы внутриклеточного перераспределения
меди.......................................................................................................................... 26
3
1.4.3 Препараты на основе меди в терапии опухолевых заболеваний ... 27
1.4.4 Применение препаратов на основе меди в диагностике опухолевых
заболеваний............................................................................................................. 29
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................ 32
2.1 Источник наночастиц, солей и органических комплексов меди.......... 32
2.2 Культивирование клеточных линий ........................................................ 32
2.3 Анализ цитотоксичности .......................................................................... 33
2.4 Проточная цитофлуориметрия ................................................................. 33
2.4.1 Кинетика гибели клеток ..................................................................... 33
2.4.2 Детекция АФК..................................................................................... 34
2.4.3 Окрашивание Аннексин V-FITC/PI................................................... 34
2.4.4 Распределение фаз клеточного цикла ............................................... 34
2.4.5 Трансмембранный потенциал митохондрий.................................... 34
2.4.6 Иммуноокрашивание .......................................................................... 35
2.5 Конфокальная микроскопия ..................................................................... 35
2.6 Иммуноблоттинг........................................................................................ 36
2.7 Атомно-абсорбционная спектроскопия. ................................................. 37
2.8 Эксперименты с искусственными мембранами ..................................... 37
2.8.1 Формирование плоских бислоев и регистрация токов,
протекающих через мембраны.............................................................................. 37
2.8.2 Флуориметрия утечки кальцеина из липосом.................................. 37
2.8.3 Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия липосом . 38
2.9 Исследование противоопухолевой активности комбинации наночастиц
CuO и N-ацетилцистеина на модели асцитной опухоли Эрлиха у мышей BALB/с
...................................................................................................................................... 39
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ...................................................................................... 41
3.1 Получение медьсодержащих соединений............................................... 41
3.2 Цитотоксичность наночастиц CuO значительно повышается в
присутствии N-ацетилцистеина ............................................................................... 44
3.3 Исследование специфичности реакции между CuO и NAC ................. 48
3.4 Исследование параметров клеточной гибели......................................... 51
3.4.1 Определение времени гибели ............................................................ 51
3.4.2 Клеточная гибель провоцируется окислительным стрессом.......... 53
4
3.4.3 Комбинация наночастиц CuO и NAC способствует изменению
акивности митохондрий......................................................................................... 54
3.4.4 Обнаружение признаков апоптотической гибели ........................... 57
3.4.5 Комбинация способна влиять на клеточный цикл клеток MDA-MB231 и HCT116.......................................................................................................... 58
3.4.6 Комбинация НЧ CuO и N-ацетилцистеина не вызывает активацию
классических апоптотических путей или некроптоза ........................................ 62
3.5 Наночастицы CuO обладают низкой способностью проникать внутрь
клетки.......................................................................................................................... 67
3.6 Комбинация НЧ CuO и NAC изменяет проницаемость искусственных
фосфолипидных мембран ......................................................................................... 69
3.6.1 Измерение утечки флуоресцентного красителя из больших везикул
в присутствии NAC и наночастиц из CuO........................................................... 71
3.6.2 Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия в
присутствии NAC и наночастиц из CuO.............................................................. 72
3.7 Взаимодействие медьорганических комплексов с NAC ....................... 75
3.8 Выявление химической природы взаимодействия между
медьсодержащими соединениями и N-ацетилцистеином..................................... 81
3.9 Исследование противоопухолевой активности комбинации in vivo ... 85
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................... 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 101
ВЫВОДЫ........................................................................................................... 104
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .............................................. 106
