СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................................5
ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................15
1.1. Киназные комплексы TOR и SnRK1 как центральные переключатели
анаболизма и катаболизма у растений.......................................................................15
1.1.1.1. Структура белка TOR...........................................................................15
1.1.1.2. Комплексы на основе киназы TOR.....................................................16
1.1.1.3. Регуляция активности TORC1 ............................................................17
1.1.1.4. Гены, кодирующие компоненты TORC1, и мутации по ним ..........19
1.1.2.1. Структура комплекса SnRK1 и регуляторы его активности............21
1.1.2.2. Подсемейство киназ SnRK2 ................................................................25
1.1.2.3. Подсемейство киназ SnRK3 ................................................................28
1.2. Роль киназных комплексов TOR и SnRK1 в развитии и метаболизме
растений в благоприятных и стрессовых условиях..................................................29
1.3. Автофагия, ее структурные особенности и регуляция в клетках растений.40
1.3.2.1. Регуляция автофагии киназами TOR и SnRK1..................................44
1.3.2.2. Регуляция автофагии абсцизовой кислотой (АБК)...........................46
1.3.2.3. Регуляция автофагии брассиностероидами .......................................47
1.3.2.4. Участие салицилатов и жасмонатов в регуляции автофагии...........48
1.3.2.5. Некоторые ингибиторы автофагии, применяемые в исследованиях
растений 48
1.4. Роль ионов калия в метаболизме и стрессоустойчивости растений.............50
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ....................................................................................57
2.1. Объект исследования и условия выращивания...............................................57
2.1.1. Поверхностная стерилизация семян Arabidopsis thaliana.......................57
2.1.2. Выращивание A. thaliana в стерильной культуре и грунте.....................58
2.1.2.1. Выращивание A. thaliana в стерильной культуре .............................58
2.1.2.2. Выращивание A. thaliana в стерильной культуре на средах с
различным содержанием калия............................................................................59
2.1.2.3. Выращивание A. thaliana в стерильной культуре на средах с
добавлением 3-MA ................................................................................................61
2.1.2.4. Выращивание A. thaliana в грунте......................................................61
2.1.2.5. Выращивание A. thaliana в грунте в условиях солевого стресса.....61
2.2. Методы исследования .......................................................................................62
3
2.2.1. Морфометрические методы .......................................................................62
2.2.2. Методы молекулярной биологии ..............................................................62
2.2.2.1. Выделение тотальной РНК..................................................................62
2.2.2.2. Очистка тотальной РНК от полисахаридов .......................................63
2.2.2.3. Электрофорез РНК в агарозном геле..................................................64
2.2.2.4. Определение концентрации нуклеиновых кислот ............................64
2.2.2.5. Очистка тотальной РНК и постановка обратной транскрипции .....64
2.2.2.6. Полимеразная цепная реакция ............................................................65
2.2.2.7. ПЦР в реальном времени.....................................................................65
2.2.3. Методы работы с белками..........................................................................67
2.2.3.1. Выделение суммарного белка из растительной ткани .....................67
2.2.3.2. Денатурирующий электрофорез белков в ПААГ..............................68
2.2.3.3. Вестерн-блоттинг .................................................................................69
2.2.3.4. Окрашивание ПААГ-геля Кумасси G-250.........................................71
2.2.3.6. Построение зависимости интенсивности сигнала от концентрации
белка и поиск линейного диапазона изменения концентраций........................72
2.2.3.7. Определение эффективных концентраций ингибиторов TOR ........77
2.2.4. Определение уровня АТФ..........................................................................78
2.2.5. Флуоресцентная микроскопия ...................................................................78
2.2.5.1. Детекция и количественный анализ автофагосом с помощью
окраски монодансилкадаверином........................................................................78
2.2.6. Импульсная флуориметрия ........................................................................79
2.2.6.1. Световые кривые ..................................................................................79
2.2.6.2. Электрохимический градиент на тилакоидных мембранах.............80
2.2.6.3. Скрипт для измерения электрохимического градиента и его
компонентов...........................................................................................................82
2.2.7. Статистический анализ...............................................................................83
2.2.7.1. Скрипт для ANOVA с Tukey HSD test ...............................................83
3. РЕЗУЛЬТАТЫ...........................................................................................................85
3.1. Исследование влияние дефицита калия на активность киназы TOR и
индукцию автофагии у проростков Arabidopsis thaliana .........................................85
3.1.1. Влияние дефицита калия на морфометрические показатели проростков.
85
3.1.2. Недостаток калия и энергетический обмен в клетках корней проростков
87
4
3.1.3. Роль калия в регуляции генов, кодирующих ферменты, участвующие в
гликолизе, митохондриальном дыхании и ассимиляции азота............................88
3.1.4. Влияние дефицита калия в среде проращивания на деградацию общего
белка проростков Arabidopsis thaliana....................................................................90
3.1.5. Исследование изменения уровня активности TOR-киназы в условиях
дефицита калия методом вестерн-блоттинга.........................................................91
3.1.6. Уровни экспрессии генов, кодирующих каталитические субъединицы
SnRK1 - KIN10 и KIN11, у трансгенных линий Arabidopsis, экспрессирующих
конструкты p35S::KIN10 (KIN10OX) и p35S::kin10(RNAi) (KIN10RNAi)..........93
3.1.7. Изучение роли SnRK1 в активации автофагического потока при
дефиците калия .........................................................................................................95
3.2. Участие SnRK1 в регуляции процессов фотосинтеза.................................97
3.2.1. Фенотипические изменения растений под действием солевого стресса
97
3.2.2. Изучение показателей эффективности ФСI и ФСII у растений с разным
уровнем экспрессии KIN10 при солевом стрессе ..................................................98
3.2.3. Электрохимический градиент и скорость синтеза АТФ.......................104
3.2.4. Уровень продукции АТФ в проростках Arabidopsis thaliana ...............106
4. ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................................................107
4.1. Хронический дефицит калия в среде выращивания оказывает
ингибирующее воздействие на активность киназы TOR и активирует
автофагию................................................................................................................107
4.2. Киназа SnRK1 участвует в регуляции фотосинтетической активности
хлоропластов в норме и в ходе ответа на солевой стресс ..................................110
ВЫВОДЫ .......................................................................................................................113
БЛАГОДАРНОСТИ ......................................................................................................114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................115
