Введение
1. Обзор литературы 9
Интеграза вируса иммунодефицита человека 9
1.1 Вирус иммунодефицита человека 9
1.1.1 Общая характеристика ВИЧ 9
1.1.2 Цикл репликации ретровируса ВИЧ 9
1.2ИнтегразаВИЧ-1 11
1.2.1 Строение и каталитические свойства ИН ВИЧ -1 12
1.2.1.1 Строение каталитического домена 14
1.2.1.2 Строение N-концевого домена 17
1.2.1.3 Строение С-концевого домена 19
1.2.1.4 Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы 21
1.2.1.5 Структура полного фермента 23
1.2.2 Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 с олигонуклеотидами и ДНК 26
1.2.2.1 Взаимодействие интегразы с ДНК 26
1.2.2.1.1 Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК 26
1.2.2.1.2 Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК 27
1.2.2.1.3 Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК 30
1.2.2.2 Взаимодействие ИН ВИЧ-1 с олигонуклеотидами 32
1.2.3 Олигомеризация ИН ВИЧ-1 34
1.2.3.1 Роль олигомерного состояния ИН во взаимодействии с ДНК 38
1.2.4 Реакция интеграции вирусной ДНК 40
1.3 Подходы к изучению механизмов узнавания ДНК ДНК-зависимыми ферментами 43
1.3.1 Типы взаимодействий при узнавании ДНК различными белками и ферментами 46
2. Экспериментальная часть 48
2.1 Реактивы и материалы 48
2.2 Методы 51
2.2.1 Электрофоретический анализ белков 51
2.2.2 Окраска ПААГ нитратом серебра 51
2 2 3 Опоепеление концентрации белков 51
2.2.4 Концентрирование препаратов белка 52
2.2.5 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов 52
2.2.6 Получение меченого субстрата 52
2.2.7 Получение Р32-меченых олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы .53
2.2.8 Анализ влияния различных олигонуклеотидов на реакцию З-процессинга 53
2.2.9 Подготовка препаратов ИН для измерения методом МУРР 55
2.2.10 Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния 55
2.2.11 Определение олигомерных форм ИН электрофорезом в ПААГ 55
2.2.12 Разделение иммуноглобулинов из крови ВИЧ-инфицированных больных 56
2.2.13 Иммобилизация белка на BrCN-сефарозу 56
2.2.14 Аффинная хроматография AT на ИН-сефарозе 56
2.2.15 «Кислотный шок» препаратов антител 57
2.2.16 Хроматография на колонке с иммобилизованными AT против легких цепей IgG
человека 57
2.2.17 Определение протеолитической активности антител 57
2.2.18 Определение субстратной специфичности иммуноглобулинов 58
2.2.19 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность антител .58
2.2.20 Определение типа протеолитической активности иммуноглобулинов с помощью ингибиторного анализа 58
2.2.21 Определение оптимального значения рН реакции гидролиза интегразы 59
2.2.22 Определение кинетических параметров реакции гидролиза субстрата антителами59
2.2.23 Тестирование ИН-гидролизуюицей активности AT после электрофореза 59
2.2.24 Модификация продуктов гидролиза ИН ВИЧ-антителами 59
2.2.25 Метод MALDI-TOF 60
3. Результаты и их обсуждение 61
3.1 Взаимодействие интегразы с различными олигонуклеотидами 61
3.1.1 Взаимодействие ИН со «стандартным» субстратом 61
3.1.2 Взаимодействие фермента с различными олигонуклеотидами 63
3.1.2.1 Взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с неспецифическими одноцепочечными олигонуклеотидами 63
3.1.2.2 Сродство ИН к неспецифическим ДНК-дуплексам 69
3.1.2.3 Активация ИН специфическими олигонуклеотидами 70
3.1.2.4 Сродство ИН к специфическим олигонуклеотидам 72
3.1.2.5 Сродство ИН к специфическим ДНК дуплексам 75
3.1.2.6 Термодинамическая модель взаимодействия ИН ВИЧ-1 со специфической последовательностью ДНК 76
3 2 Влияние нуклеотидов на олигомерное состояние интегразы 81
3.2.1 Подбор условий проведения экспериментов методом МУРР 83
3.2.3 Анализ взаимодействия ИН ВИЧ-1 с ДНК методом МУРР 85
3.2.4 Кинетическая схема олигомеризации ИН 87
3.2.5 Анализ кинетической схемы олигомеризации ИН 90
3.2.6 Расчет радиуса инерции олигомерных форм ИН-ON 92
3.2.7 Определение количества олигомерных форм ИН 95
3.2.8 Гипотетическая схема взаимодействия интегразы со специфическими и неспецифическими ON 97
3.3 Иммуноглобулины крови ВИЧ-инфицированных больных 102
3.3.1 Выделение иммуноглобулинов класса G и М из крови ВИЧ-инфицированных больных 104
3.3.2 Доказательства принадлежности каталитической активности непосредственно иммуноглобулинам 105
3.3.3 Анализ сродства AT к интегразе и их субстратная специфичность 108
3.3.4 Определение типа протеолитической активности AT 110
3.3.5 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность AT 112
3.3.6 Определение рН-оптимума гидролиза ИН антителами 114
3.3.7 Определение кинетических параметров реакции гидролиза интегразы иммуноглобулинами 114
3.3.8 Анализ продуктов гидролиза интегразы иммуноглобулинами классов G и М 116
3.3.8.1 Определение продуктов гидролиза ИН электрофорезом в ПААГ 116
3.3.8.2 Анализ продуктов гидролиза методом масс-спектрометрии 117
Выводы 123
Список литературы 124
