Введение
Глава 1. ГК: строение и свойства, биологические функции и метаболизм у различных организмов, получение и применение.
1.1. История открытия ГК и основные этапы ее изучения . 11
1.2. Химическое строение и некоторые физико-химические свойства 15 ГК.
1.2.1. Пространственная структура ГК. Вторичная и третичная 18
структуры ГК в водных растворах.
1.3. Нахождение и биологические функции ГК у различных организмов. 22
1.3.1. Наличие ГК у организмов разных таксонов. 22
1.3.2. ГК в тканях млекопитающих и человека. Функции ГК. 24
1.3.3. ГК как компонент капсул бактерий. 27
1.4. Метаболизм ГК. 31
1.4.1. Биосинтез ГК. Биохимические и генетические аспекты 31
процесса: ферменты, гены, регуляция.
1.4.1.1. Биохимический путь синтеза ГК. 31
1.4.1.2. Функциональные и кинетические характеристики, 34
локализация, строение и каталитический механизм действия гиалуронатсинтаз.
1.4.1.3. Характеристика оперона синтеза ГК бактерий 40
p. Streptococcus: структура, клонирование и регуляция экспрессии.
1.4.2. Катаболизм ГК у бактерий p. Streptococcus. 44
1.4.2.1. Классификация ферментов, осуществляющих 44 деполимеризацию ГК.
1.4.2.2. Гиалуронатлиаза бактерий p. Streptococcus: 45 функциональные и кинетические характеристики, строение, механизм действия.
1.4.2.3. Биологическая роль гиалуронатлиаз у бактерий p. Streptococcus. 50
1.5. Получение ГК. 51
1.5.1. Получение ГК экстракцией из животного сырья. 51
1.5.2. Получение ГК микробиологическим синтезом. 53
1.5.2.1. Штаммы-продуценты ГК. 5 3
1.5.2.2. Среды, условия и режимы культивирования штаммов-продуцентов ГК.
1.6. Практическое использование ГК. 61
1.6.1. Медицинское применение ГК. 62
1.6.2. Применение ГК в косметологии. 64
1.7. Заключение. 65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы и методы. 67
2.1. Материалы . 67
2.2. Объекты исследования. 67
2.3. Условия культивирования S. zooepidemicus. 67
2.4. Условия проведения энзиматической деполимеризации ГК. 68
2.5. Выделение ГК из КЖ S. zooepidemicus. 69
2.6. Аналитические методы. 70
2.6.1. Анализ ГК. 71
2.6.2. Анализ глюкозы и продуктов метаболизма S. zooepidemicus. 73 2.6.3.«Определение концентрации биомассы S. zooepidemicus. 73
2.6.4. Электрофорез белков в ПААГ. 74
2.6.5. Определение молекулярной массы ГК вискозиметрическим методом. 75
2.7. Микробиологические методы исследований. 76
2.8. Аппаратурные методы исследований. 76
2.9. Методы статистической обработки результатов исследования. 77
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Биосинтез ГК культурой S. zooepidemicus. 78
3.1. Выбор объекта исследования . 78
3.2. Выбор среды культивирования. 79
3.3. Кинетика роста и синтеза ГК штаммом & zooepidemicus В-8014 при глубинном культивировании. 82
3.4. Определение гиалуронидазной активности штамма S. zooepidemicus В-8014. 84
3.5. Получение мукоидных штаммов S. zooepidemicus воздействием 86i
УФ.
3.6. Оптимизация состава питательной среды и режимов 94
культивирования S. zooepidemicus КБ-04.
3.6.1. Оптимизация состава питательной среды методом 94
Плаккета-Бурмана.
3.6.2. Зависимость биосинтеза ГК бактериями p. Streptococcus от 98 вида источника углерода и энергии.
3.6.3. Влияние концентрации глюкозы в питательной среде на 99 рост культуры и биосинтез ГК. Определение ингибирующей концентрации глюкозы.
3.6.4. Определение оптимальных значений рН для синтеза ГКкультурой S. zooepidemicus КБ-04. 102
3.6.5. Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. 104
3.6.6. Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГКS. zooepidemicus. ГК как фактор защиты от токсического действия кислорода. 107
3.6.7. Биосинтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04 при глубинном культивировании с рН-статированием и подпитками по субстрату. 114
3.7. Заключение. 116
Глава 4. Деполимеризация ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. 117
4.1. Выбор объектов исследования. 117
4.2. Реологические свойства растворов различных образцов ГК. 119
4.3. Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.
4.3.1.-Кинетическая схема деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. 127
4.3.2. Вискозиметрический метод наблюдения за ходом реакции деполимеризации ГК. 129
4.3.3. Вискозиметрическое определение активности бактериальных гиалуронатлиаз.
4.3.4. Спектрофотометрический метод кинетических исследований расщепления ГК и определение активности стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.3.5. Определение продуктов деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой методом ВЭЖХ. 135
4.3.6. Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе 136 деполимеризации ГК.
4.3.7. Определение оптимальных условий функционирования 140 стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.4. Биологическая функция гиалуронатлиаз как ферментов катаболизма ГК, снабжающих бактерии p. Streptococcus источником углерода и энергии. 141
4.5. Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной 144 молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной ГК.
4.6. Определение ГК методом ВЭЖХ по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронатлиазой. 146
4.7. Заключение. 149
Основные результаты и выводы. 150
Список использованной литературы. 152
