Введение
1 Обзор литературы 8
1. Строение люцифераз светляков 8
1.1. Механизм биолюминесцентной реакции люциферазы 8
1.2. Первичные структуры люцифераз жуков 9
1.3. Пространственная структура и активный центр люциферазы светляков 11
2. Спектры биолюминесценции люцифераз 16
2.1. Особенности спектров биолюминесценции люцифераз жуков 16
2.2. Физико-химические представления о влиянии окружения на спектры испускания флуорофоров 17
2.3. Механизмы изменения спектров биолюминесценции, описанные в литературе. 21
2.4. Связь между структурой и спектрами биолюминесценции люцифераз 28
3. Стабильность люциферазы светляков 31
3.1. Факторы, влияющие на стабильность люциферазы светляков 31
3.2. Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза 33
3.3. Повышение устойчивости ферментов к действию органических растворителей методом мутагенеза 36
2 Экспериментальная часть 38
1. Вещества и реагенты 38
2. Штаммы и плазмиды 40
3. Аппаратура 41
4. Методики проведения экспериментов 42
4.1. Выделение и очистка люциферазы 42
4.2. Изучение свойств люциферазы 44
4.3. Методы работы с ДНК 47
4.4. Конструирование плазмид 48
4.5. Получение мутантной формы люциферазы с заменой G216N, A217N методом сайт-направленного мутагенеза 51
4.6. Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза 51
4.7. Получение мутантных форм люциферазы с повышенной термостабильностью методом направленной эволюции 55
4.8. Компьютерное моделирование и анализ структуры люциферазы L. mingrelica 56
3 Результаты и обсуждение 57
1. Получение и свойства двойного мутанта G216N,A217L 57
1.1. Получение и физико-химические свойства мутанта 57
1.2. Спектры биолюминесценции 58
1.3. Термостабильность мутанта G216N,A217L 61
1.4. Обсуждение эффектов замены G216N,A217L 62
2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа 65
2.1. Конструирование использованных плазмид 65
2.2. Экспрессия генетических конструкций и очистка рекомбинантных ферментов.. 70
2.3. Сравнение свойств различных форм рекомбинантной WT-люциферазы 74
3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза 78
3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции 79
3.2. Выделение, каталитические свойства и стабильность мутантов 82
3.3. Спектры биолюминесценции мутантов 83
2.1. Обсуждение эффекта замены Y35 на Asn, His 89
4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО 92
5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной эволюции 96
5.1 Случайный мутагенез и скрининг мутантов по термостабильности 97
5.2 Кинетические свойства и спектры биолюминесценции мутанта 4TS 104
5.3 Термостабильность мутанта 4TS 106
5.4 Сравнение свойств мутанта 4TS и нативной люциферазы 109
Выводы 111
