Введение
1. Обзор литературы. Глюкокортикоиды в терапии злокачественных новообразований 15
1.1. Молекулярные основы применения глюкокортикоидов в терапии онкологических заболеваний 15
1.1.1. Функционирование глюкокортикоидов в организме 15
1.1.1.1. Регуляция синтеза и активности эндогенных глюкокортикоидов 15
1.1.1.2. Глюкокортикоидный рецептор 18
1.1.1.3. Механизмы действия глюкокортикоидов 18
1.1.2. Современное использование глюкокортикоидов в химиотерапии онкологических заболеваний 23
1.1.2.1. Использование глюкокортикоидов в качестве цитостатических препаратов при лечении опухолей кроветворной системы 23
1.1.2.2. Использование глюкокортикоидов в качестве противовоспалительных препаратов при терапии солидных опухолей 27
1.2. Роль глюкокортикоидного рецептора в регуляции сигнальных путей, определяющих злокачественную трансформацию клетки 31
1.2.1. Влияние глюкокортикоидов на пролиферативный потенциал клеток опухолей (клеточный цикл, рост-ингибирующие факторы, иммортализация) 31
1.2.2. Роль глюкокортикоидов в индукции апоптоза 33
1.2.3. Влияние глюкокортикоидов на неоангиогенез 39
1.2.4. Влияние глюкокортикоидов на эпителиально-мезенхимальный переход, инвазию и метастазирование 41
1.2.5. Влияние глюкокортикоидов на клеточную дифференцировку 49
1.2.6. Глюкокортикоиды и генетическая нестабильность 53
1.2.7. Влияние глюкокортикоидов на сигнальные пути, связанные с развитием множественной лекарственной устойчивости 56
1.2.8. Влияние глюкокортикоидов на метаболизм опухолевой клетки 62
1.2.9. Подавление противоопухолевого иммунитета и эффекты глюкокортикоидов на этот процесс 68
1.3. Современные подходы к избирательной активации глюкокортикоидного рецептора в терапии злокачественных новообразований 73
1.3.1. Лиганды глюкокортикоидного рецептора, используемые в терапии или изучаемые в качестве перспективных новых средств 73
1.3.1.1. Классические агонисты и антагонисты глюкокортикоидного рецептора 73
1.3.1.2. Модифицированные глюкокортикоиды 74
1.3.1.3. Селективные агонисты глюкокортикоидного рецептора 77
1.3.1.4. Механизмы действия селективного агониста глюкокортикоидного рецептора, CpdA .79
1.3.1.5. Перспективы использования CpdA в клинической практике 83
1.3.2. Ингибирование «генов побочных эффектов» глюкокортикоидов 89
1.3.2.1. Роль REDD1 в канцерогенезе и функционировании глюкокортикоидного рецептора .90
1.3.2.2. Основные эффекторы GR в реализации побочного действия глюкокортикоидов 94
1.3.2.3. Перепрофилирование лекарственных препаратов в онкологии и использование этого подхода при поиске ингибиторов побочных эффектов глюкокортикоидов 98
1.4. Заключение 108
2. Материалы и методы 109
2.1. Список используемых реактивов 109
2.2. Список используемых приборов 112
2.3. Синтез энантиомеров CpdA 112
2.4. Синтез химических производных CpdA 113
2.5. Синтез наночастиц золота и липопротеинов высокой плотности (HDL NP) 116
2.6. Клеточные линии 117
2.7. Определение цитотоксического эффекта и кинетики пролиферации 117
2.8. Определение уровня апоптоза 118
2.9. Выделение РНК и обратная транскрипция 119
2.10. Полуколичественный ПЦР-анализ 119
2.11. Количественный ПЦР-анализ 119
2.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле 121
2.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле с SDS 122
2.14. Вестерн блоттинг 122
2.15. Трансформация бактериальных клеток 122
2.16. Выделение плазмидной ДНК 123
2.17. Приготовление сред и растворов для работы с бактериями 123
2.18. Использованные генетические конструкции 123
2.19. Трансдукция клеток лентивирусными векторами 124
2.20. Определение активности люциферазы 124
2.21. Оценка связывания лигандов GR с рецептором 125
2.22. Бактериальный тест на мутагенную активность Эймса 125
2.23. Выделение моноцитарной фракции крови крови пациентов 126
2.24. Анализ профилей экспрессии генов на ДНК-микрочипах Illumina 126
2.25. Биоинформатический скрининг потенциальных ингибиторов REDD1 126
2.26. Оценка противоопухолевой активности in vivo на ксенографтах лимфомы у бестимусных мышей 126
2.27. Оценка противоопухолевой активности CpdA-03 in vivo на модели перевиваемой лимфомы Р388 у мышей 127
2.28. Оценка атрофических и воспалительных процессов in vivo у мышей 127
2.29. Оценка влияния глюкокортикоидов in vivo на кожу здоровых добровольцев 128
2.30. Гистологический и иммунохимический анализ 128
2.31. Морфометрический анализ 129
2.32. Статистическая обработка данных 129
3. Результаты исследования 130
3.1. Оценка противоопухолевого эффекта селективного агониста глюкокортикоидного рецептора (SEGRA), 2-(4-ацетофенил)-2-хлор-N-метилдиэтиламмоний хлорида или CpdA 131
3.1.1. Оценка противоопухолевого эффекта CpdA in vitro и ex vivo 131
3.1.2. Исследование способности CpdA к запуску транс-репрессии и транс-активации глюкокортикоидного рецептора 137
3.1.3. Определение противоопухолевого эффекта CpdA in vivo 143
3.1.4. Исследование совместного влияния CpdA и противоопухолевых препаратов различных классов на жизнеспособность опухолевых клеток 145
3.2. Разработка подходов к получению новых SEGRA на основе молекулы CpdA 159
3.2.1. Получение наночастиц золота, содержащих CpdA, и оценка их противоопухолевого эффекта in vitro 159
3.2.2. Исследование противоопухолевой активности энантиомеров CpdA 161
3.2.2.1. Разработка подходов к получению энантиомеров CpdA 161
3.2.2.2. Оценка антипролиферативного и проапоптотического эффектов энантиомеров CpdA 164
3.2.2.3. Исследование способности энантиомеров CpdA к запуску транс-репрессии и трансактивации глюкокортикоидного рецептора 166
3.2.2.4. Исследование мутагенной активности энантиомеров CpdA 170
3.2.3. Исследование противоопухолевой активности химических производных CpdA 172
3.2.3.1. Разработка подходов к получению химических производных CpdA 173
3.2.3.2. Оценка противоопухолевого эффекта химических производных CpdA in vitro 174
3.2.3.3. Оценка влияния новосинтезированных химических производных CpdA на функциональную активность глюкокортикоидного рецептора 177
3.2.3.4. Исследование мутагенной активности химических производных CpdA 184
3.2.3.5. Оценка противоопухолевого эффекта наиболее активного химического производного CpdA, CpdA-03, in vivo 189
3.3. Модулирование функции глюкокортикоидного рецептора с использованием направленной регуляции GR-зависимых генов 190
3.3.1. Анализ профилей экспрессии генов с целью поиска ключевых генов, регулирующих развитие побочных эффектов глюкокортикоидов 190
3.3.2. Биоинформатический скрининг баз данных для поиска потенциальных ингибиторов REDD1 и предварительный скрининг их биологических эффектов in vitro 193
3.3.3. Оценка влияния рапамицина на GR–зависимую экспрессию гена REDD1 199
3.3.4. Влияние ингибитора экспрессии REDD1 рапамицина на активацию GR 203
3.3.4.1. Действие рапамицина на ядерную транслокацию и фосфорилирование GR 203
3.3.4.2. Оценка степени запуска механизмов транс-репрессии и транс-активации 205
3.3.5. Исследование влияния рапамицина на эффекты глюкокортикоидов in vivo 208
3.3.5.1. Противоопухолевый эффект в комбинации глюкокортикоидов с рапамицином 208
3.3.5.2. Влияние рапамицина на GC-индуцированную атрофию кожного покрова 210
3.3.5.3. Оценка влияния рапамицина на GC-индуцированную атрофию кожного покрова и костной ткани при системном применении 215
4. Обсуждение результатов 217
4.1. Повышение противоопухолевых эффектов сигнального пути GR посредством использования SEGRA 217
4.1.1. Противоопухолевые свойства CpdA 217
4.1.2. Походы к разработке новых SEGRA 219
4.2. Модулирование функциональной активности глюкокортикоидного рецептора посредством ингибирования REDD1 222
4.2.1. Ингибирование REDD1 как результат использования биоинформатического подхода к поиску путей снижения побочных эффектов глюкокортикоидов 222
4.2.2. Влияние рапамицина на терапевтические и побочные эффекты глюкокортикоидов 223
Заключение 227
Выводы 228
Список сокращений 229
Список литературы 235
