Введение
1. Геномный импринтинг - эпигенетическиии феномен регуляции дифференциальной активности аллельных генов импринтированных локусов 14
1.1. Геномный импринтинг фактор неэквивалентности материнского и отцовского геномов у млекопитающих 16
1.2. Геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы 21
1.3. Идентификация и особенности импринтированных генов 24
2. Процессы метилирования деметилирования ДНК основной механизм возникновения геномного импринтинга 31
2.1. Формирование паттернов метилирования 31
2.2. Метилирование ДНК - основной механизм импринтирования генов 38
2.2.1. Этапы метилирования - деметилирования генома в онтогенезе мыши 38
2.2.2. Нарушение геномного импринтинга в результате мутаций, затрагивающих процессы метилирования 44
2.3. Болезни человека, обусловленные нарушением геномного импринтинга 48
3. Геномный импринтинг и проблема партеногенеза у млекопитающих 52
3.1. Способность к партеногенезу в различных группах животных 52
3.2. Типы партеногенетических зародышей и особенности партеногенетического развития яйцеклеток млекопитающих , 54
3.3. Получение искусственных партеногенов млекопитающих 56
3.4. Развитие и причины гибели партеногенетических зародышей млекопитающих 58
3.5. Развитие партеногенетических клеточных клонов в составе химерных организмов млекопитающих 61
3.5.1. Партеногенетические химеры 64
3.5.2. Андрогенетические химеры 69
4. Партеногенез и модуляция эффектов геномного импринтинга 73
4.1. Деметилирование ДНК и модуляция эффектов геномного импринтинга 73
4.2. Характеристика соединений, обладающих выраженными деметилирующими свойствами 78
4.2.1. Деметилирующее действие 5-азацитидина и модуляция экспрессии генов 78
4.2.2. Деметилирующие свойства ретиноевой кислоты 80
4.3. Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга 82
4.4. Модуляция экспрессии импринтированных генов полипептидными ростовыми факторами 84
Часть II Собственные исследования
5. Материалы и методы 88
5.1. Экспериментальные животные 88
5.1.1. Анестезия, умерщвление 88
5.1.2. Вазэктомия 89
5.1.3. Суперовуляция, датировка беременности, выделение ранних эмбрионов мышей 89
5.2. Получение партеногенетических зародышей 90
5.3. Культивирование in vitro одноклеточных эмбрионов до стадии бластоцисты 90
5.4. Получение партеногенетических химер 91
5.4.1. Агрегация восьмиклеточных эмбрионов и трансплантация бластоцист в матку ложнобеременных самок 91
5.4.2. Анализ распределения партеногенетических клеточных клонов в составе химерного организма 93
5.4.2.1. Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове химер C57BL/6 D BALB/c 93
5.4.2.2. Распределение партеногенетических клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаза 95
5.5. Культивирование in vitro нормальных (оплодотворенных) и партеногенетических эмбрионов мышей на постимплантационных стадиях развития 97
5.6. Электрофоретический анализ изоферментов глюкозофосфатизомеразы 97
5.7. Анализ влияния деметилирующих соединений на нормальные (оплодотворенные) и партеногенетические эмбрионы мышей 100
5.7.1. Обработка 5-азацитидином 100
5.7.2. Обработка ретиноевой кислотой 101
5.8. Анализ влияния ростовых факторов на партеногенетических эмбрионов мышей 101
5.9. Анализ экспрессии импринтированногр гена Igf-2 методом in situ гибридизации на тотальных препаратах и гистологических срезах 102
5.10. Статистическая обработка данных 104
6. Результаты 105
6.1 Партеногенетическое развитие эмбрионов мышей - модельная система для изучения геномного импринтинга в эмбриогенезе млекопитающих 105
6.1.1. Изучение межлинейных различий в способности к партеногенетическому развитию эмбрионов мышей C57BL/6 и СВА 105
6.1.2. Влияние 5-азацитидина на экспрессию генов локуса Gpi-1 на ранних стадиях преимплантационного развития нормальных (оплодотворенных) эмбрионов мышей C57BL/6 и СВА 110
6.1.3. Пролонгирование развития нормальных и партеногенетических эмбрионов на постимплантационных стадиях in vitro 113
6.1.3.1. Культивирование нормальных (оплодотворенных) постимплантационных эмбрионов 114
6.1.3.2. Культивирование диплоидных партеногенетических эмбрионов линии СВА 117
6.1.3.3. Культивирование диплоидных партеногенетических эмбрионов (СВА xC57BL/6)Fl 120
6.2. Модуляция эффектов геномного импринтинга при изменении генетической среды 121
6.2.1. Анализ партеногенетических клеточных клонов у химерных мышей C57BL/6(PG) -»BALB/c 121
6.2.1.1. Постнатальное развитие партеногенетических химер 121
6.2.1.2. Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове 122
6.2.1.3. Распределение партеногенетических клеточных клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаз 126
6.2.1.4. Распределение партеногенетических клеточных клонов во внутренних органах и тканях химер шестимесячного возраста 129
6.2.1.5. Постимплантационное развитие и клональный анализ партеногенетических химерных эмбрионов 130
6.3. Модулирующее влияние деметилируюііщх соединений на эффекты геномного импринтинга 133
6.3.1. Влияние неспецифического деметилирующего соединения ретиноевой кислоты на развитие диплоидных 134
партеногенетических эмбрионов мышей C57BL/6, СВА 134
6.3.1.1. Применение ретиноевой кислоты на доимплантационных стадиях развития 136
6.3.1.2. Влияние на имплантацию и постимплантационное развитие 137
6.3.1.3. Применение ретиноевой кислоты в постимплантационном периоде развития 138
6.3.2. Действие 5-азацитидина на развитие диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей C57BL/6, СВА и (CBAxC57BL/6)Fl 139
6.3.2.1. Влияние 5-азацитидина на развитие яйцеклеток, активированных к партеногенезу 140
6.3.2.2. Воздействие 5-азацитидина на развитие партеногенетических зародышей на стадии бластоцисты 143
6.3.2.3. Влияние 5-азацитидина на постимплантационное развитие партеногенетических эмбрионов после внутрибрюшинных инъекций различных доз препарата самкам-реципиентам 144
6.4. Модуляция эффектов геномного импринтинга ростовыми факторами 148
6.4.1. Изучение влияния ростовых факторов семейства факторов роста фибробластов (FGF) на развитие диплоидных партеногенетических зародышей (СВА х C57BL/6)F 1 149
6.4.1.1. Действие FGF2 и FGF4 на развитие партеногенетических зародышей на стадии морулы 150
6.4.1.2. Совместное влияние FGF2 и инсулиноподобного ростового фактора (IGF2) на партеногенетические зародыши in vitro 153
6.4.2. Изучение влияния трансформирующего ростового фактора а (TGFa) 158
6.4.2.1. Влияние на развитие эмбрионов доимплантационнных стадий и имплантацию в матку ложнобеременных самок 159
6.4.2.2. Влияние на постимплантационное развитие эмбрионов и плаценты 160
6.4.3. Анализ влияния TGFa на экспрессию импринтированного reHa/gf-2 161
Обсуждение 165
Выводы 184
Список литературы 188
Приложение 217
1 .Паттерны распределения пигментированных участков шерстного покрова у партеногенетических химер C57BL/6(PG)«-»BALB/c 218
2.Список сокращений 221
