Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы. факторы терминации трансляции 8
1.1. Факторы терминации трансляции у прокариот 9
1.2. Эукариотические факторы терминации трансляции... 11
1.2.1. Факторы терминации трансляции первого класса (eRFl) 11
1.2.2. Факторы терминации трансляции второго класса (eRF3) 14
1.2.3. Белок Sup35 - дрожжевой фактор eRF3 19
1.2.4. [РЯҐ] — прионная форма eRF3 S. cerevisiae 22
1.3. Супрессия нонсенс-кодонов или принцип неоднозначности терминации трансляции 23
1.3.1. Факторы, влияющие на эффективность нонсенс-супрессии 25
1.3.2. Частичная инактивация факторов терминации трансляции 27
1.4. Белки, взаимодействующие с факторами терминации трансляции .29
1.4.1. Комплекс eRFl и eRF3 29
1.4.2. Взаимодействие факторов терминации трансляции с белками Upfl, Upf2nUpf3 31
1.4.3. Взаимодействие eRF3 с РаЫ 34
1.4.4. Взаимодействие eRFl и eRF3 с другими белками 36
Заключение . 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Штаммы .40
2.2. Плазмиды .42
2.3. Среды и условия культивирования 44
2.4. Генетические методы 44
2.4.1. Получение мутантов по гену SUPS5 45
2.4.2. Замещение плазмид 45
2.5. Молекулирно-генетические методы 46
2.5.1, Секвенирование 47
2.6. Методы работы с РНК 49
2.7. Методы работы с белками 50
2.7.1. Получение белковых экстрактов 50
2.7.2. Получение антител, специфичных к eRF3 51
2.7.3. Иммунопреципитация . 52
2.7.4. Иммуноблотинг 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1. Получение мутантов по гену SUP35 и анализ молекулярной природы полученных мутаций 54
3.1.1. Получение мутантов по гену SUP35 54
3.1.2. Оценка содержания белка eRF3 у полученных мутантов 55
3.1.3. Фенотипическая характеристика полученных мутантов sup35 57
3.1.4. Молекулярная природа мутантных аллелей sup35 59
3.2. Изучение нонсенс-мутаций sup35. Возможные механизмы, обеспечивающие жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP35, 62
3.2.1. Нонсенс-мутации sup35 способны поддерживать жизнеспособность штаммов в отсутствие мутантных супрессорных тРНК 62
3.2.2. Мутантная супрессорная тРНК SUQ5 повышает жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации sup35 69
3.2.3. Нуклеотидный контекст нонсенс-мутаций sap35> полученных в данной работе 74
3.2.4. Изучение уровня эндогенных тРНК в штаммах, несущих мутации sup35 76
3.3. Анализ белков eRF3 и eRFl у нонсенс- и миссенс-мутантов sup35...19
3.3.1. Анализ белка eRF3 79
3.3.2. Анализ содержания белка eRFl у мутантов sup35 84
3.3.3. Миссенс-мутации sup35, полученные в работе (а также мутация sup35-217), не нарушают взаимодействие белков eRF3 и eRFl 86
3.4. Процесс деградации мРНК, содержащих нонсенс-мутации (NMD),
нарушен у мутантов sup35 и sup45 87
3.4.1. Анализ содержания мРНК SUP35 у мутантов sup35 87
3.4.2. Секвенирование мутантных аллелей his7-l, lys9-A2I и trpl-289 Z9
З А3, мРНК his7-l является субстратом для деградации при помощи процесса NMD 91
3.4.4. мРНК his7-l и CYH2, содержащие нонсенс-мутации, накапливаются у мутантов sup35 и s ир45 94
ГЛАВА 4. Обсуждение 97
4.1. Нонсенс-мутации в генах SUP35 и SJJP45 98
4.1.1. Локализация нонсенс-мутаций sup35 100
4.1.2. Жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации sup35 и sup45 101
4.2. Другие типы мутаций в гене SUP35, полученные в работе 106
4.2.1. Миссенс-мутации sup35 . 106
4.2.2. Повтор нуклеотидов , 107
4.2.3. Мутация неизвестной природы 108
4.3. Содержание белка eRFl у мутантов sup35 108
4.4. Влияние мутаций sup35 и sup45 на процесс NMD 109
Выводы 113
Список литературы 114
