Введение
1 Обзор литературы 14
1.1 Основные этапы в исследовании вируса гриппа 14
1.2 Общие сведения о вирусе гриппа птиц
1.2.1 Таксономическая принадлежность, классификация и номенклатура. Природноочаговый характер вируса гриппа А 18
1.2.2 Строение вириона 19
1.2.3 Организация генома, изменчивость вируса 20
1.2.4 Дикие птицы как природный резервуар вируса гриппа птиц 23
1.2.5 Циркуляция вируса гриппа А среди млекопитающих 25
1.3 Вирус гриппа у водных млекопитающих 28
1.3.1 Грипп в популяциях морских млекопитающих 33
1.4 Вирус гриппа околоводных млекопитающих 45
1.5 Экологические особенности территории юга Западной Сибири и роль данного региона в циркуляции вируса гриппа А 46
1.6 Экологические особенности Каспийского региона и роль данного региона в циркуляции вируса гриппа А 48
1.7 Заключение по обзору литературы 51
2. Собственные исследования 54
2.1 Материалы и методы 54
2.2 Сбор и хранение биологических образцов 54
2.3 Выделение и размножение вирусов из биологического материала в системе РКЭ 55
2.4 Создание коллекции штаммов вируса гриппа 56
2.4.1 Наработка пулов штаммов 56
2.4.2 Лиофилизация штаммов вируса гриппа 56
2.5 Изучение молекулярно-биологических и патогенных свойств штаммов вируса гриппа А 57
2.5.1 Вирус 57
2.5.2 Экспериментальные животные 57
2.5.3 IVPI тест 58
2.5.4 Схемы экспериментов на мышах 59
2.5.5 Вирусологические методы исследования 60
2.5.5.1 Изучение способности вируса к репродукции на РКЭ 60
2.5.5.2 Изучение способности вируса к репродукции на культуре клеток 61
2.5.6 Молекулярно-биологические методы исследования 61
2.5.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 61
2.5.6.1.1 Выделение РНК 61
2.5.6.1.2 Реакция обратной транскрипции 62
2.5.6.1.3 ГЩР-амплификация в режиме реального времени и детекция продуктов амплификации 62 2.5.6.2 Секвенирование генома 63
2.5.6.3 Филогенетический и аминокислотный анализ 64
2.5.7 Серологические методы исследования 65
2.4.7.1 Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации 65
2.5.8 Гистологические методы исследования 66
2.5.8.1 Световая микроскопия 66
2.5.8.2 Иммуногистохимический анализ 67
2.5.9 Статистический анализ 67
3 Результаты собственных исследований 68
3.1 Исследование вируса гриппа в популяции ондатр на Чановской озерной системы, Новосибирская область 69
3.1.1 Выделение вируса гриппа птиц А от ондатры в системе РКЭ 69
3.1.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенного от ондатры 71
3.1.2.1 Филогенетический анализ штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) 71
3.1.2.2. Оценка способности штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) к репродукции 75
3.1.2.3 Оценка патогенности штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) на модельных животных 75
3.2 Исследование вируса гриппа в популяции Каспийских тюленей, о. Малый Жемчужный, Каспийский регион 76
3.2.1 Выделение штамма вируса гриппа птиц от каспийских тюленей в системе РКЭ 76
3.2.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенных от каспийских тюленей в 2002 и 2012 гг. 77
3.2.2.1 Филогенетический анализ штаммов A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 78
3.2.2.2 Аминокислотный анализ штаммов A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 82
3.2.3 Оценка способности штамма A/Caspian seai ussia7i884/2002 4N6) к репродукции in vitro, in vivo 84
3.2.4 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 86
3.2.4.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей 86
3.2.4.2Изменения структуры почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 92
3.2.4.3 Изменения ткани печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 95
3.2.4.4Изменения структур сердца в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 99
3.2.4.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 100
3.2.4.6Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 103
3.2.5 Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) к репродукции in vitro и in vivo 104
3.2.6 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 106
3.2.6.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 106
3.2.6.2 Изменения структур почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 112
3.2.6.3 Изменения структур печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 115
3.2.6.4Изменения структур сердца в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 117
3.2.6.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 118
3.2.6.6 Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) 120
4. Заключение 122
4.1 Выводы 133
Список литературы 135
Приложения 154
