Введение
Глава 1. Современные взгляды на патогенетические механизмы, клиническое течение, диагностику и методы лечения пузырчатки (обзор литературы) 19
1.1 Эпидемиология пузырчатки 19
1.2 Роль генетической предрасположенности в развитии пузырчатки 20
1.3 Роль толл-подобных рецепторов в развитии пузырчатки 24
1.4 Современная концепция патогенеза пузырчатки 28
1.4.1 Аутоантитела при пузырчатке 28
1.4.1.1 Антитела и клинический фенотип пузырчатки 32
1.4.2. Антигены при пузырчатке 35
1.4.2.1 Структурный компонент десмосом белок PERP и ген PERP 36
1.4.3 Патофизиология акантолиза при пузырчатке 38
1.5 Клиническая картина пузырчатки 41
1.5.1 Клинические индексы в оценке тяжести пузырчатки 44
1.6 Методы диагностики пузырчатки 52
1.7 Современные методы терапии пузырчатки 56
1.8 Экспериментальное моделирование пузырчатки 70
Глава 2. Материалы и методы исследования 75
2.1 Материалы исследования 75
2.2 Методы исследования 76
2.2.1 Клиническое обследование больных пузырчаткой 79
2.2.1.1 Оценка степени тяжести пузырчатки с использованием клинических индексов 80
2.2.2 Цитологическое исследование мазков-отпечатков для определения акантолитических клеток Тцанка 83
2.2.3 Первичная обработка биопсийного материала 85
2.2.4 Морфологическое исследование 87
2.2.5 Реакция непрямой иммунофлюоресценции с использованием ex vivо конфокального лазерного сканирующего микроскопа для выявления фиксированных антител (IgА, IgМ, IgG) 89
2.2.6 Реакция иммунофлюоресценции с использованием ex vivо конфокального лазерного сканирующего микроскопа для изучения экспрессии структурного белка десмосом белка PERP 91
2.2.7 Метод обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов в режиме реального времени для количественного определения экспрессии гена толл-подобного рецептора 7 типа (TLR7) 92
2.2.8 Иммуноферментный анализ для определения антител к десмоглеинам 1 и 3 типов 94
2.2.9 Метод секвенирования по Сенгеру для определения нуклеотидной последовательности гена PERP 97
2.2.10 Методологии, использованные при получении экспериментальной модели пузырчатки на лабораторных животных 100
2.3.10.1 Выделение и очистка антител класса G из сывороток крови больных пузырчаткой и здоровых лиц методом аффинной хроматографии. 100
2.2.10.2 Проведение экспериментальных работ с введением лабораторным животным (новорожденным мышам линии ВALB/c) препаратов суммарных IgG человека 104
2.2.11 Технологии, использованные при создании иммуносорбента для селективного удаления аутоантител к Dsg3 из крови больных пузырчаткой 108
2.2.11.1 Иммуносорбция антител к десмоглеину 3 типа из препаратов суммарных IgG, полученных из пула сывороток крови больных пузырчаткой 111
2.2.11.2 Применение иммуносорбента для удаления антител к Dsg3 из крови больных пузырчаткой .112
2.2. Статистическая обработка данных 114
Глава 3. Результаты клинических исследований больных пузырчаткой 116
3.1 Клиническая характеристика больных пузырчаткой 116
3.2 Клинические индексы в оценке тяжести пузырчатки 128
3.2.1 Индекс площади поражения при пузырчатке (PDAI, Pemphigus Disease Area Index) в оценке тяжести больных пузырчаткой 129
3.2.2 Балльная оценка тяжести аутоиммунного буллезного заболевания кожи (ABSIS, Autoimmune Bullous Skin Disorder Intensity Score) в оценке тяжести больных пузырчаткой 132
3.2.3 Индекс активности вульгарной пузырчатки (PVAS, Pemphigus Vulgaris Activity Score) в оценке тяжести больных пузырчаткой 135
3.2.4 Корреляция индексов PDAI, ABSIS, PVAS и DIDS у больных пузырчаткой 137
Глава 4. Результаты лабораторных исследований при обследовании больных пузырчаткой 141
4.1 Результаты цитологического, морфологического, иммунофлюоресцентного методов исследования при обследовании больных пузырчаткой 141
4.2 Результаты изучения уровня циркулирующих антител к десмоглеинам 1 и 3 типов у больных пузырчаткой 145
4.3 Результаты изучения патогенетической роли гена PERP и кодируемого им структурного белка десмосом PERP в развитии пузырчатки 153
4.3.1 Характеристика белок-кодирующей последовательности экзонов гена PERP у больных пузырчаткой и оценка возможной взаимосвязи полиморфизмов с клиническими особенностями заболевания 153
4.3.2 Результаты определения экспрессии белка PERP в коже больных пузырчаткой 166
4.4 Оценка роли толл-подобного рецептора 7 типа в патогенезе пузырчатки на основании изучения его экспрессии в коже больных методом ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени 172
Глава 5. Результаты экспериментальных исследований 178
5.1 Создание экспериментальной модели пузырчатки на лабораторных животных (неонатальных мышах инбредной линии BALB/c) 178
5.2 Разработка и оценка in vitro и in vivo эффективности экспериментального способа элиминации антител к десмоглеину 3 типа из крови больных пузырчаткой 187
5.2.1 Создание иммуносорбента для селективного связывания и удаления аутоантител - IgG к десмоглеину 3 типа из крови больных пузырчаткой 187
5.2.2 Оценка in vitrо эффективности экспериментального способа элиминации антител к десмоглеину 3 типа из суммарных IgG, выделенных из сывороток крови больных пузырчаткой .191
5.2.3 Оценка in vivo эффективности экспериментального способа элиминации антител к десмоглеину 3 типа из крови больных пузырчаткой 193
5.2.4. Оценка in vitrо эффективности экспериментального способа элиминации антител к десмоглеину 3 типа из крови больных пузырчаткой 197
Заключение выводы 223
Практические рекомендации 225
Список сокращений 226
Список литературы 228
Приложение 257
