Введение
Глава 1 Обзор литературы 48
1.1 Общие сведения о туляремийной инфекции 48
1.2 Эпидемиология туляремии
1.2.1 Туляремия в бывшем Советском Союзе и в России 53
1.2.2 Туляремия в странах Европы 58
1.2.3 Туляремия в Северной Америке 61
1.3 Внутривидовое разнообразие возбудителя туляремии 64
1.3.1 Таксономия Francisella tularensis 64
1.3.2 Молекулярно-генетическая видовая и подвидовая идентификация возбудителя туляремии 68
1.3.3 Генетические основы биохимических различий подвидов F. tularensis 82
1.4 Туляремийные вакцины 90
1.4.1 История создания и использования живой туляремийной вакцины 90
1.4.2 Сравнительная характеристика эффективности туляремийных вакцин 92
1.4.3 Иммунные реакции макроорганизма при введении живой туляремийной вакцины 96
1.4.4 Современные подходы к созданию улучшенной живой туляремийной вакцины 105
1.5 Основные подходы к изучению потенциальных туляремийных вакцинных штаммов 115
1.5.1 Существующие требования к оценке туляремийной живой вакцины 115
1.5.2 Новые методические приемы при изучении потенциальных туляремийных вакцинных штаммов 119
1.5.3 Использование лабораторных животных для экспериментальной туляремии при разработке вакцин против этого заболевания 121
1.6 Заключение по обзору литературы 131
Собственные исследования
Глава 2 Генодиагностика туляремийного микроба 134
2.1 Создание тест-системы «MULTI-FLU» для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 134
2.1.1 Обоснование выбора праймеров и зондов 138
2.1.2 Подбор условий амплификации 139
2.1.3 Оценка аналитической специфичности 140
2.1.4 Проверка зашифрованных проб набором для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов 142
2.2 Создание праймера Chi 1f для дифференциации подвидов туляремийного микроба 145
2.2.1 Создание системы из одного праймера для дифференциации подвидов туляремийного микроба на основе специфических регионов хромосомы фланкированных chi – последовательностями, подобными E. coli 146
2.2.2 Результаты испытаний ПЦР с использованием одного праймера Chi1f для дифференциации подвидов туляремийного микроба 146
2.3 Генотипирование штаммов туляремийного микроба 148
2.3.1 Изучение генотипического разнообразия штаммов F. tularensis из коллекции ГНЦ ПМБ методом MLVA-типирования по 25 VNTR-локусам 149
2.3.2 Обнаружение на территории Алтайского края Российской Федерации F. tularensis subsp. mediasiatica 159
2.3.3 Оптимизирование числа VNTR-локусов, сохраняющее разрешающую способность MLVA-типирования на уровне метода A. Johansson 163
2.4 Обсуждение результатов 165
Глава 3 Направленный мутагенез генов F. Tularensis 171
3.1 Конструирование суицидного плазмидного вектора pGM5 для аллельного обмена генов в хромосоме F. tularensis 172
3.2 Конструирование суицидного плазмидного вектора pGM6 175
3.3 Создание с помощью суицидных векторов pGM5 и pGM6 плазмид с инактивированными генами оперонов igl, rec, qse, pur и bla и получение вариантов штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с делецией перечисленных генов 1 3.3.1 Конструирование штамма с делецией гена qseC на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 177
3.3.2 Конструирование штамма с делецией генов purMCDN на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 181
3.3.3 Конструирование штамма с делецией гена iglC (одной и двух копий) на основе штамма 15 НИИЭГ F. tularensis 183
3.3.4 Конструирование штаммов с делецией генов системы рекомбинации recA и recD на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 186 3.3.5 Конструирование штаммов с делецией генов bla1, bla2,
bla3 на основе штамма 15 НИИЭГ F. tularensis 192
3.4 Обсуждение результатов 197
Глава 4 Влияние мутаций генов QSEC, PUR, RECA, RECD, IGLC И BLA НА биологические свойства рекомбинантных штаммов F. Tularensis 202
4.1 Влияние гена qseC на иммунобиологические свойства
вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 202
4.1.1 Влияние гена qseC на культурально-морфологические свойства штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 202
4.1.2 Влияние гена qseC на чувствительность к нормальной кроличьей сыворотке штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 203
4.1.3 Влияние гена qseC на способность рекомбинантного штамма к фагоцитозу и приживаемости в организме мышей линии BALB/c 204
4.1.4 Влияние гена qseC на остаточную вирулентность и протективные свойства F. tularensis 15 НИИЭГ 208
4.1.5 Влияние делеции гена qseC на структуру липополисахарида внешней мембраны штамма 15 НИИЭГ F. tularensis 210
4.2 Влияние генов purMCDN, кодирующих ферменты биосинтеза пуринов, на иммунобиологические свойства вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 214
4.2.1 Влияние генов purMCDN на культурально-морфологические свойства штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 215
4.2.2 Влияние генов purMCDN на чувствительность к нормальной кроличьей сыворотке 216
4.2.3 Влияние генов purMCDN на способность рекомбинантного штамма к фагоцитозу и приживаемости в организме мышей линии BALB/c 216
4.2.4 Влияние генов purMCDN на остаточную вирулентность и протективные свойства F. tularensis 15 НИИЭГ 219
4.3 Влияние гена iglC на иммунобиологические свойства
вакцинного вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 221
4.3.1 Влияние гена iglC на культурально-морфологические свойства и чувствительность к нормальной кроличьей сыворотке 221
4.3.2 Влияние гена iglC на способность к фагоцитозу и приживаемости в организме мышей линии BALB/c 222
4.3.3 Оценка влияния гена iglC на степень остаточной вирулентности и протективные свойства штамма 225 F. tularensis \5 НИИЭГ
4.3.4 Влияние гена iglC на реактогенные свойства штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (по изменению веса и гематологическим показателям мышей линии BALB/c) 226
4.3.5 Влияние инактивации гена iglC в вакцинном штамме F. tularensis \5 НИИЭГ на формирование гуморального и клеточного иммунитета к туляремии у мышей линии BALB/c 231
4.4 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD на иммунобиологические свойства вакцинного туляремийного штамма 233
4.4.1 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD на культурально-морфологические свойства и чувствительность к нормальной кроличьей сыворотке штамма
F. tularensis 15 НИИЭГ 234
4.4.2 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD на устойчивость штамма F. tularensis 15 НИИЭГ к ультрафиолетовому облучению и воздействию перекиси водорода 237
4.4.3 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD в штамме F. tularensis 15 НИИЭГ на способность к фагоцитозу и приживаемости в организме мышей линии BALB/c 238
4.4.4 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD в штамме F. tularensis 15 НИИЭГ на степень остаточной вирулентности и протективные свойства 241
4.4.5 Влияние генов системы рекомбинации гесА и recD на реактогенные свойства штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (по изменению веса и гематологическим показателям мышей линии BALB/c) 242
4.4.6 Оценка влияния генов системы рекомбинации гесА и recD в штамме F. tularensis 15 НИИЭГ на формирование гуморального и клеточного иммуннитета при иммунизации мышей линии BALB/c 245
4.5 Влияние генов Ыа на иммунобиологические свойства вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 247
4.5.1 Изучение чувствительности F. tularensis к антибиотикам класса -лактамов 248
4.5.1.1 Сравнение чувствительности к Р-лактамам штаммов F. tularensis в зависимости от подвидовой принадлежности 248
4.5.1.2 Определение чувствительности к антибиотикам штаммов F. tularensis с инактивированными генами - 252 лактамаз
4.5.1.3 Комплементация чувствительности к ампициллину плазмидами, несущими маркер ампициллин-резистентности 255
4.5.1.4 Изучение сравнительной -лактамазной активности F. tularensis subsps. mediasiatica и holarctica и штаммов F. tularensis 15bla2 и F. tularensis 15bla123 256
4.5.2 Влияние генов bla в штамме F. tularensis 15 НИИЭГ на ростовые и иммунопротективные свойства штамма 259
4.6 Обсуждение результатов 261
Глава 5. Получение и изучение иммунобиологических свойств штамма F. TULARENSIS 15/23-1RECA – прототипа живой туляремийной вакцины 270
5.1 Сравнительная оценка культурально-морфологических и иммунобиологических свойств прототипа живой туляремийной вакцины F. tularensis 15/23-1recA и родительского штамма F. tularensis 15 НИИЭГ 270
5.1.1 Изучение культурально-морфологических свойств штамма F. tularensis 15/23-1recA 270
5.1.2 Изучение способности штамма F. tularensis 15/23-1recA к внутриклеточному размножению в культуре первичных перитонеальных макрофагов и в культуре макрофагоподобных клеток линии J774.1A 272
5.2 Оценка остаточной вирулентности, безвредности,
стабильности и реактогенности, иммуногенных и защитных
свойств прототипа живой туляремийной вакцины 274
5.2.1 Определение остаточной вирулентности штамма F. tularensis 15/23-1recA для морских свинок и мышей линии BALB/c 275
5.2.2 Оценка приживаемости штамма F. tularensis 15/23-1recA по степени и длительности обсемененности селезенки морских свинок и мышей линии BALB/c 276
5.2.3 Оценка патоморфологических изменений у морских свинок и мышей линии BALB/c, вызываемых введением штамма F. tularensis 15/23-1recA 278
5.2.4 Определение стабильности биологических свойств испытуемого вакцинного штамма на морских свинках 281
5.2.5 Оценка реактогенности штамма F. tularensis 15/23-1recA по изменению веса морских свинок и мышей линии BALB/c 282
5.2.6 Оценка влияния штаммов F. tularensis 15НИИЭГ и 15/23-1recA на гематологические показатели морских свинок и мышей линии BALB/c 286 5.2.7 Оценка формирования гуморального и клеточного иммунного ответа на штамм F. tularensis 15/23-1recA у морских свинок и мышей линии BALB/c 289
5.2.8 Оценка иммуногенной активности штамма F. tularensis 15/23-1recA для морских свинок и мышей линии BALB/c 292
5.2.9 Сравнение длительности и напряженности иммунитета у мышей линии Balb/c при иммунизации штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и штаммом F. tularensis 15/23-1recA 293
5.3 Обсуждение результатов 297
Глава 6 Алгоритм оценки штаммов f. tularensis потенциальных кандидатов для создания улучшеной туляремийной вакцины 301
6.1 Использование клеточной линии J774.1A на первом этапе исследований кандидат-вакцин 301
6.2 Использование динамики изменения веса и гематологических показателей мышей линии BALB/c в качестве критериев реактогенности потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы 303
6.3 Определение специфического иммунитета с использованием комплексного туляремийного антигена (УЗД) F. tularensis 15 НИИЭГ в качестве критерия иммуногенности потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы 304
6.4 Обсуждение результатов 305
Заключение 309
Выводы 317
Практические рекомендации 320
Перспективные направления дальнейшей разработки темы 321
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов 323
Cписок использованных источников
