Введение
1. Обзор литературы 13
1. 1. Ядерные рецепторы и механизмы регуляции их активности 13
1. 1. 1. Суперсемейство ядерных рецепторов: биомедицинское значение, филогения и номенклатура 13
1. 1.2. Роль состояния хроматина в активации транскрипции ядерньми рецепторами 18
1. 1. 3. Доменная структура ЯР 19
1. 1.4. Особенности связывания ЯР с гормоночувствительными элементами 21
1. 1. 5. Лиганд-связывающий домен - мышеловка для лиганда 23
1. 1. 6. Связывание корегуляторов и коактиваторный карман 25
1. 1. 7. Корегуляторы, отличные от коактиваторов и корепрессоров 29
1. 1. 8. Регуляция активности орфановых рецепторов 30
1. 1.9. Альтернативные механизмы регуляции активности ядерных рецепторов 32
1. 2. Орфановые рецепторы подсемейства NR5a: роль в развитии и метаболизме и механизмы активации 35
1.2. 1. Роль орфановых рецепторов стероидогенного фактора 1 и гомолога рецептора печени 1 в раннем развитии и метаболизме 35
1. 2. 2. Мутации в гене SF-1 у человека 36
1. 2. 3. Роль LRH-1 в регуляции метаболизма холестерина 38
1. 2. 4. SF-1 и LRH-1: механизмы активации, в отсутствие лиганда 40
1. 2. 4. 1. Роль Dax-І и SHP в регуляции активности SF-1 и LRH-1 40
1.2. 4. 2. Активация SF-1 и LRH-1 через сигнальные пути 41
Заключение 43
2. Материалы и методы 45
2. 1. Плазмиды 45
2. 2. Культура клеток 45
2. 3. Экспрессия и очистка белка 46
2. 4. In vitro трансляция, in vitro фосфорилирование, ограниченный протеолиз и температурное плавление 48
2. 5. Моделирование вторичной структуры белков 49
2. 6. Аналитическое ультрацентрифугирование 50
2.7. Кристаллизация лиганд-связывающего домена LRH-1, получение набора рамок диффракции и интеграция данных 50
3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Влияние фосфорилирования SF-1 по сайту Ser на транскрипионную активность и конформацию SF-1 52
3. 1. 1. Транскрипционная активность SF-1 зависит от фосфорилирования по сайту Ser в шарнирном домене 52
3. 1.2. Erk-2 фосфорилирует SF-1 in vitro 55
3. 1.3. Erk-2-зависимое фосфорилирование SF-1 повышает взаимодействие с кофакторами in vivo 56
3. 1.4. Фосфорилирование SF-1 с помощью Erk-2 вызывает конформационное изменение в шарнирном домене 60
3. 1.5. Фосфорилирование SF-1 с помощью Erk-2 не имитирует действие лиганда 64
3. 1.6. Эксперименты по температурному плавлению свидетельствуют в пользу активной конформации лиганд-связывающих доменов SF1 и LRH1... 66
3. 2. Структурные основы независимой от лиганда активности орфановых рецепторов подсемейства NR5a 69
3. 2. 1. Получение рентгеносруктурной модели лиганд-связывающего домена LRH-1 69
3. 2. 2. Особенности структуры лиганд-связывающего домена LRH-1 71
3. 2. 3. LRH-1 содержит большой, но пустой лигандный карман 73
3. 2. 4. Спираль Н2 является интегральным стабилизирующим элементом, ответственным за активную конформацию лиганд-связывающего домена 77
3. 2. 5. Наружная поверхность спирали Н2 является специфической для подсемейства NR5a поверхностью связывания корегуляторов 80
3. 2. 6. Особенности структуры и функции 1ЛШ-1Ю52Еи SF-l1*2551- 82
3. 2. 7. Архитектура коактиваторной бороздки LRH-1 85
3. 2. 8. Структурное объяснение мономерной природы LRH-1 88
3. 3. LRH-1 и SF-Г. пути регуляции контитутивной активности, в отсутствие лиганда 90
3. 3. 1. Регуляция активности LRH-1 через киназные сигнальные пути 91
3.3.2. Домены белок-белкового взаимодействия за пределами лиганд- связывающего домена: регуляторная роль шарнирного домена 92
Заключение 95
Выводы 98
Список цитируемой литературы 100
