Введение
I. Обзор литературы 13
1.1. Пикорнавирусы 13
1.2. Полиовирус 16
1.2.2. Полиовирусная РНК 18
1.2.3. Белки полиовируса 19
1.2.4. Полиовирусный белок ЗА 23
1.3. Апоптоз 24
1.3.1. Общая характеристика 24
1.3.2. Апоптоз, индуцируемый прямой стимуляцией «рецепторов смерти» TNFR и FAS 25
1.4. Везикулярный белковый транспорт 28
1.4.1. Общая схема 28
1.4.2.Цитоскелет и молекулярные моторы в мембранном транспорте белков 28
1.4.3. Динеин и аппарат Гольджи 30
1.4.4. Разрушение аппарата Гольджи под воздействием дрожжевого метаболита брефельдина А 31
1.5. LIS1 и его роль в регуляции функций линейна 32
1.6. Клеточные функции пирина 35
1.7. Биоактивность кверцетина 36
П. Материалы и методы 38
II. 1. Работа с культурами эукариотических клеток 38
П. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование 38
11.1.2. Трансфекция 39
II. 1.3. Упаковка лентивирусных частиц 39
И.1.4. Очистка вирионов и трансдукция 40
II.1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности заражения клеток 41
II.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование 41
П.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli 41
П.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli 42
11.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 43
П.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 43
П.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 43
П.2.6. Цитирование ДНК 43
-П.2.7. Векторы и плазмидныс конструкции, использованные в работе 44
П.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих полипептиды полиовируса...44 П.2.9. Получение конструкций, экспрессирующих полноразмерные пирин и LIS1 и фрагменты LIS1 46
П.2.10. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК- интерференции 46
П.4. Методы выделения и анализа белков 47
П.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов 47
П.4.2. Приготовление ядерных экстрактов 48
П.4.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорда 49
П.4.4. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция 49
П.4.5. Иммунопреципитация 51
П.4.6. Иммунофлуоресценция 52
II.4.7. Очистка белков методом аффинной хроматографии с исользованием GST
(GST-пулл-даун) 55
И.4.8. Измерение кверцетиназной активности пирина 55
II.5. Экспрессия белков in vitro 55
П.6. Индукция апоптоза с использованием TNFct и антител к FAS 55
И.7. Анализ ДНК-белковых взаимодействий методом сдвига электрофорезной подвижности 56
11.8. Метод цитофлуоресцентного анализа 56
11.9. Дрожжевая двугибридная система 57
III. Результаты и обсуждение 61
III. 1. Полиовирусные белки 2В и ЗА блокируют апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли. Ингибирование везикулярного транспорта белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи как потенциальный молекулярный механизм 61
III. 1.1. Получение мини-библиотеки плазмид, экспрессирующих неструктурные белки полиовируса 61
III. 1.2. Полиовирусные белки ЗА и 2В снижают чувствительность клеток HeLa и NIH3T3 к воздействию фактора некроза опухоли TNFa в присутствии ингибитора белкового синтеза или полиовирусной протеазы 2А 62
III. 1.3. ПВ белки 2В и ЗА подавляют везикулярный транспорт белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 65
III.2. Полиовирусныи белок ЗА ингибирует TNF-зависимый апоптоз засчёт умеьшения количества TNF рецептора на клеточной поверности 66
III.2.1. Белок ЗА и брефельдин А уменьшают количество TNFR1 на клеточной поверхности 66
Ш.2.2. Полиовирусная инфекция подавляет деградацию ІкВа в ответ на обработку TNFcc 69
Ш.2.3. TNFR1 быстро исчезает с клеточной поверхности во время полиовирусной инфекции 70
П.2.4. Обработка TNFa не вызывает активацию NFKB В присутствии ЗА и брефельдина А 71
Ш.З. Поиск клеточных интеракторов полиовирусного белка ЗА методом скринирования библиотеки кДНК в дрожжевой двухгибридной системе 73
Ш.3.1. Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе 73
Ш.3.2. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и LIS1 in vitro и in vivo 75
Ш.4. LIS1 как клеточный интерактор ЗА 77
Ш.4.1. Ко-локализация LIS 1 и ЗА в клетке 78
Ш.3.2. Гиперэкспрессия белка LIS1 снимает ингибирование белкового транспорта из ЭР в Гольджи полиовирусным белком ЗА 79
Ш.3.3. Гиперэкспрессия LIS1 препятствует уменьшению количества TNFR1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА 80
Ш.3.4. Экспрессия N- и С-концевых делеционных мутантов LIS1 уменьшает количество TNFR1 на клеточной поверхности 82
III.4. Пирин как клеточный интерактор ЗА 85
Ш.4.1. Колокализация ЗА и пирина в клетках HeLa, зараженных полиовирусом.86 Ш.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину коррелирует с экспрессией пирина в различных клеточных линиях 88
Ш.4.3. Кверцетин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках HeLa 90
И.4.4. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНК-интерференции модулирует устойчивость полиовируснои инфекции к воздействию кверцетина 91
Ш.4.5. Белок ЗА не меняет кверцетиназную активность пирина 94
IV. Модель молекулярных механизмов подавления анти-инфекционных защитных систем клетки-хозяина в экспериментальной полиовируснои инфекции 95
Выводы 97
Благодарности 98
Список работ, опубликованных по теме диссертации: 99
Список литературы: 99
