Введение
ГЛАВА 1 . Магнитотаксис и магнитотактические бактерии 8
1.1 Морфология и филогенетическое разнообразие магнитотактических бактерий 8
ГЛАВА 2. Магнетосомы 12
2.1 Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом 12
2.2. Мембрана магнетосом 13
2.3 Белки мембраны магнетосом 15
ГЛАВА 3. Биоминерализация магнетосом 20
3.1 Геномная организация магнетосомальных генов 20
3.2. Биосинтез магнетосом 25
ГЛАВА 4. Практическое примение магнетосом экпериментальная часть 34
ГЛАВА 5. Материалы и методы 34
5.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 34
5.2 Культивирование бактерий 34
5.3 Выделение и очистка магнетосом 35
5.4 Выделение ДНК 36
5.5 Выделение высокомолекулярной ДНК 37
5.6. Получение генетических конструкций методом ПЦР 37
5.7. Детектирование продуктов ПЦР 39
5.8. Очистка ПЦР-фрагментов 39
5.9. Рестрикция ДНК 40
5.10. Лигирование ДНК 40
5.11 Фосфорилирование ДНК 40
5.12 Выделение плазмидной ДНК 40
5.13. Секвенирование ДНК 41
5.14 Приготовление химически компетентных клеток 41
5.15. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 41
5.16. Экспрессия белка методом автоиндукции 42
5.17 Анализ суммарного белка клеток E. coli BL21(DE3) 42
5.18 Вестерн-блот анализ 43
5.19. Фракционирование растворимых клеточных белков E. coli 43
5.20. Очистка гибридных белков 44
5.21. Иммуноферментный анализ 45
5.22. Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом 46
5.23. Оптимизация интеграции гибридных белков в мембрану магнетосом 46
5.24. Световая и просвечивающая электронная микроскопия 47
5.25. Атомно-силовая микроскопия 47
5.26. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей 48
5.27. Секвенирование и аннотирование генома Magnetospirillum sp. SO-1 48
5.28. Реконструкция магнетосомального геномного острова Magnetospirillum sp.
SO-1 48
Результаты и их обсуждение 60
ГЛАВА 6. Описание объекта исследований 60
6.1. Морфологические и физиологические особенности магнитотактической бактерии Magnetospirillum sp. SO-1 60
6.2. Секвенирование и анализ генома Magnetospirillum sp. SO-1 61
6.3. Сборка и аннотирование магнетосомального геномного острова Magnetospirillum sp. SO-1 64
6.4. Сравнительный анализ магнетосомальных геномных островов представителей рода Magnetospirillum 69
ГЛАВА 7. Получение магнетосом с иммобилизованными на поверхности антителами 71
7.1. Получения магнетосом с целостной мембраной 71
7.2. Проектирование и сборка генетических конструкций 72
7.2.1. Получение генетической конструкции mb 73
7.2.2. Получение генетической конструкции mbb 77
7.2.3. Получение генетической конструкции mzz 80
7.2.4. Получение генетической конструкции mistbb 83
7.3. Получение гибридных иммуноглобулинсвязывающих белков 84
7.3.1. Экспрессия pET23a(+)/mb, pET23a(+)/mbb, pET23a(+)/mzz и pET23a(+)/mistbb 84
7.3.2. Фракционирование белков 86
7.3.3. Очистка гибридных белков 87
7.4. Исследование функциональной активности модифицированных белков 88
7.5. Встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом 91
7.6. Анализ результатов МАПО при интеграции гибридных белков Mbb и Mistbb
94
7.7. Исследование модифицированных магнетосом с использованием атомно-силовой микроскопии 100
7.8. Определение стабильности модифицированных магнетосом 102
Заключение 104
Выводы 105
Благодарности 106
Список литературы
