Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы 8
2.1. Пространственная организация ДНК в нуклеопротеидных комплексах 8
2.1.1. Пространственная организация ДНК в ядрах клеток 8
2.1.2. Пространственная структура ДНК и регуляция работы генома 8
2.1.3. Значение пространственной организации ДНК для функционирования регуляторных систем 10
2.1.4. Конформация ДНК и строение хроматина 11
2.2. Структура, динамика, молекулярные перестройки хроматина 13
2.2.1. Конформационная подвижность ДНК в хроматине 13
2.2.2. Молекулярные механизмы, повышенной конформационной подвижности ДНК в хроматине 16
2.2.3. Влияние ацетилирования гистонов на организацию и молекулярные перестройки хроматина 18
2.2.4. Перестройки структуры хроматина макромолекулярными белковыми комплексами 18
2.3. "Нестандартные" структуры ДНК и их роль в функционировании ДНК эукариот 20
2.4. Взаимосвязь структурных перестроек разных уровней упаковки ДНК, как основа функциональной организации хроматина 22
2.4.1. Иерархическая структура организации хроматина 22
2.4.2. Динамика ковалентно замкнутой молекулы ДНК 25
2.4.3. Молекулярный механизм взаимосвязанных структурных перестроек нуклеосомной фибриллы 27
2.4.4. Структурная иерархия хроматина и функционирование регуляторных систем 30
2.4.5. Перестройки структуры хроматина при изменении осевой закрутки межнуклеосомных линкеров 31
2.5. Контроль перестроек хроматина SET белками гомеостатической регуляции активности генов 32
3. Материалы и методы 37
3.1. Анализ топологии минихромосомной ДІЖ 37
3.2. Неэнзиматическое ацетилирование гистонов; электро-форетический анализ уровня ацетилирования гистонов 37
3.3. Изолирование"транскрипционно-активных" нуклеосом, анализ спектров кругового дихроизма (КД) ДНК 38
3.4. Анализ конформации фибрилл хроматина с помощью электрофореза в гелях агарозы низкой плотности 39
3.5. Исследование молекулярных перестроек хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 40
3.5.1. Приготовления цитоплазматического экстракта эмбрионов дрозофилы 40
3.5.2. Приготовление гистонов и реконструкция хроматина 40
3.5.3. Анализ реконструированного хроматина 41
3.5.4. Упрощенная методика получения нуклеосомных частиц. 41
3.5.5. Структурные перестройки реконструированного и изолированного хроматина 41
3.6. Исследование влияния структур ДНК на экспрессию модельного гена и локальные перестройки хроматина 42
3.6.1. Приготовление плазмидных ДНК, фрагментов ДНК 42
3.6.2. Трансфекция эукариотических клеток, анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы 42
3.6.3. Приготовление экстрактов ядер и проб для белка-активатора 43
3.6.4. Реконструкция нуклеосом на промоторе модельного гена и in vitro транскрипция полученных матриц 43
3.6.5. Анализ структуры хроматина химерных промоторов 43
3.7. Выявление изогнутых и легкоплавких последовательностей ДНК 44
3.8. Исследование фибрилл хроматина с помощью интеркаляторов 44
3.8.1. Культуры клеток и индукция гиперацетилирования гистонов 44
3.8.2. Интеркаляции дифосфата хлороквина в клетках культуры 45
3.8.3. Трипсинолиз концевых доменов гистонов изолированных ядер 45
3.8.4. Интеркаляция бромистого этидия в изолированных ядрах 45
3.8.5. Анализ хроматина фиксированных ядер 46
3.9. Исследование ДНК-белковых взаимодействие области SET факторов гомеостатической регуляции генов 46
4. Результаты 47
4.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конформационной подвижности ДНК модельной минихромосомы 47
4.1.1. Координированное изменение ацетилирования гистонов и сверхспирализации минихромосомной ДНК in vivo 47
4.1.2. Неэнзиматическая модификация гистонов in vitro 54
4.1.3. Высокая конформационная подвижность ДНК транскрип ционно-активной минихромосомы высших эукариот 54
4.2. Конформационная подвижность ДНК в нуклеосомах транскрйпционно-активного хроматина 57
4.2.1. Изолирование "транскрипционно-активных нуклеосом 62
4.2.2. Спектры кругового дихроизма нуклеосом 64
4.3. Конформационная подвижность и перестройки фибрилл хроматина. Электрофорез в гелях агарозы низкой плотности 67
4.3.1. Электрофоретический анализ фибрилл хроматина 67
4.3.2. Конформационная подвижность нуклеосомных фибрилл 71
4.3.3. Реорганизация фибрилл при ацетилировании гистонов 71
4.4. Структура и молекулярные перестройки хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 76
4.4.1. Структурные перестройки реконструированного хроматина 76
4.4.2. Топологические перестройки реконструирован, хроматина 82
4.4.3. Перестройки высокоацетилированного хроматина 82
4.4.4. Структурные перестройки изолированных мононуклеосом 96
4.4.5. Включение гистонов НІ в высокоацетилированый хроматин 100
4.5. Влияние последовательности ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина 106
4.5.1. Влияние последовательности ДНК,ацетилирования гистонов на перегруппировки нуклеосом в "динамичном" хроматине 106
4.5.2. Влияние неканонических структур ДНК на перестройки хроматина и экспрессию химерного гена in vivo 112
4.5.3. Влияние неканонических структур ДНК на конститутивную активность LTR вируса саркомы Рауса 118
4.5.4. Влияние олигомеров (CG) на эффективность промотора вируса саркомы Рауса в клетках различных типов 124
4.5.5. Краткое описание модели. Конститутивная активация промотора на основе LTR вируса саркомы Рауса мономерным фактором CREB 124
4.5.6. Распределение специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена а-глобиновых генов кур 131
4.6. Исследование хроматина с помощью интеркаляторов 137
4.6.1. Интеркаляция дифосфата хлороквина в клетках in vivo 137
4.6.2. Интеркаляция бромистого этидия в ядрах клеток in vitro 139
4.6.3. Исследование хроматина с модификациями гистонов 141
4.6.4. Исследование фибрилл высокоацетилированного хроматина in vivo при интеркаляции дифосфата хлороквина 147
4.6.5. Исследование пространственной организации концевых доменов гистонов высокоацетилированного хроматина 151
4.7. Взаимодействие "SET" области факторов гомеостатической регуляции генов со структурами активного хроматина 153
4.7.1.Область SET прочно связывает однонитевые субстраты ДНК 153
4.7.2. Область SET поддерживает связывание с однонитевой ДНК
при высокой концентрации NaCl и хаотропных агентов 160
4.7.3. Область SET MLL поддерживает взаимодействие с однонитевой ДНК при сборке "динамического" хроматина 160
4.7.4. Мутация Z11 в области SET триторакса препятствует прочному связыванию с однонитевой ДНК 164
4.7.5. Определение участков связывания однонитевой ДНК в SET области ряда белков SET-группы 168
4.7.6. Оценка пространственной структуры участков связывания однонитевой ДНК в SET области 175
4.7.7. Область SET триторакса прочно связывается с свобод ными тетрамерами гистонов НЗ-Н4, но не нуклеосомами 176
5. Обсуждение результатов
5.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конфор-мационной подвижности ДНК эндогенной минихромосомы 180
5.2. Конформационная подвижности ДНК "транскрипционно-активных" нуклеосом и нуклеосомных фибрилл 181
5.3.Перестройки фибриллы хроматина при ацетилировании гистонов 181
5.4. Структура и молекулярные перестройки высокоацетилированного хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы 186
5.5. Влияние последовательности ДНК и ацетилирования гистонов на распределение нуклеосом в "динамическом" хроматине 188
5.6. Распределения специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена а-глобиновых генов кур 190
5.7. Влияние неканонических структур ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина 191
5.8. Структура и перестройки хроматина при изменении конформации межнуклеосомной ДНК 192
5.9. Взаимодействие специфических структур активного хромати на с "SET" областью белков гомеостатической регуляции генов 196
5.10. Заключение 198
6. Выводы 200
