Введение
1. Литературный обзор 14
Глава 1.1. Модификации C-концевого домена РНК-полимеразы II (CTD) 14
1.1.1. CTD 14
1.1.2. Формирование преинициаторного комплекса 15
1.1.3. Фосфорилирование CTD РНК-пол II 17
1.1.4. Другие модификации CTD РНК-пол II 21
1.1.5. Динамика фосфорилирования CTD во время транскрипции 22
1.1.6. Модель capping checkpoint 23
Глава 1.2. мРНП и CBC комплексы 25
1.2.1. мРНП комплекс 25
1.2.2. Привлечение компонентов мРНП во время биогенеза мРНК 25
1.2.3. CBC комплекс, синтез 7mG 27
1.2.4. CBC и транскрипция 29
1.2.5. CBC и биогенез мРНК 31
Глава 1.3. Транспорт белков, локализация компонентов аппарата трансляции в ядрах 33
1.3.1. Импорт и экспорт белков 33
1.3.2. Компоненты аппарата трансляции в ядрах 34
Глава 1.4. Фактор Paip2 42
1.4.1. Paip2 - ингибитор трансляции 42
1.4.2. Участие Paip2 в других процессах 46
2. Материалы и методы 49
Глава 2.1. Линии клеток и мух 49
2.1.1. Штаммы Escherichia coli 49
2.1.2. Компетентные клетки и электропорация 49
2.1.3. Линия клеток Schneider 2 (S2) D. melanogaster 49
2.1.4. Трансфекция 50
2.1.5. РНК-интерференция 50
2.1.6. Линии мух 50
Глава 2.2. Методы работы с нуклеиновыми кислотами 51
2.2.1. ПЦР и количественный ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) 51
2.2.2. Выделение РНК 51
2.2.3. Обратная транскрипция (RT-Reverse Transcription) - синтез кДНК 51
2.2.4. Синтез двуцепочечной РНК (дцРНК) 52
2.2.5. Клонирование 52
2.2.6. Список праймеров 53
Глава 2.3. Методы работы с рекомбинантными белками 56
2.3.1. Экспрессия белка индуктором - Изопропил--D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) 56
2.3.2. Аутоиндукция 56
2.3.3. Выделение рекомбинантных белков 57
2.3.4. Очистка и анализ белкового комплекса 57
2.3.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS/ПААГ) 58
2.3.6. Вестерн-блот анализ 58
2.3.7. Окрашивание белковых гелей Coomassie Blue R250 59
2.3.8. Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 59
Глава 2.4. Иммунологические методы 60
2.4.1. Антитела, использованные в работе 60
2.4.2. Получение антител 60
2.4.3. Триазиновый метод посадки белка на сефарозу 61
2.4.4. Очистка антител на колонке с пришитым антигеном 62
2.4.5. Иммунопреципитация белков 62
2.4.6. Иммунопреципитация хроматина 63
2.4.7. Иммунопреципитация РНК 64
2.4.8. Иммуноокрашивание клеток 64
2.4.9. Приготовление препаратов политенных хромосом 65
2.4.10. Иммуноокрашивание семенников 66
3. Результаты 67
Глава 3.1. Белок Paip2 локализован в ядрах различных клеток 67
3.1.1. Paip2 в ядрах S2 клеток 67
3.1.2. Paip2 в ядрах других клеток D. melanogaster 72
Глава 3.2. Paip2 ассоциирован с промоторами активных генов посредством РНК 76
3.2.1. Локализация Paip2 на политенных хромосомах 76
3.2.2. Привлечение Paip2 на промоторы экдизон-зависимых генов 77
3.2.3. Привлечение Paip2 на ген теплового шока 81
3.2.4. Paip2 связывается с ядерной мРНК 83
Глава 3.3. Очистка Paip2-содержащего белкового комплекса из ядерного эмбрионального экстракта D. melanogaster. Функциональное значение Paip2 в ядрах клеток. 86
3.3.1. Paip2 связан с факторами, локализующимися на промоторах активных генов 86
3.3.2. Paip2 и Cbp80 оказывают влияние на фосфорилированный серин 5 CTD РНК-пол II 88
3.3.3. Paip2 модифицируется PARP-полимеразой 92
4. Обсуждение 95
Заключение 98
Выводы 99
Благодарности 100
Список литературы 101
