СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................... 6
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 8
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 14
1.1 Общие сведения о сукцинатдегидрогеназе. ................................................ 14
1.1.1 Особенности структуры сукцинатдегидрогеназы ................................... 16
1.1.2 Биохимические аспекты регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы. ...................................................................................... 20
1.2 Молекулярно-эпигенетические аспекты функционирования СДГ ........... 24
1.2.1 Эпигенетическая регуляция у высших растений ..................................... 27
1.2.1.1 Метилирование ДНК ............................................................................... 29
1.2.1.2 Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов ................... 30
1.2.1.3 Эпигенетические модификации метаболизма растений в условиях абиотического стресса. ........................................................................................ 32
1.2.1.4 Метилирование промоторов и регуляция экспрессии генов, кодирующих СДГ ................................................................................................. 34
1.3 Абиотический стресс и влияние солевого стресса на метаболизм растений 37
1.3.1 Осмотический стресс ................................................................................. 38
1.3.2 Ионный стресс ............................................................................................ 39
1.3.3 Окислительный стресс ............................................................................... 41
1.3.4 Влияние засоления на функциональность цикла трикарбоновых кислот. 42
1.3.5 Электрон-транспортная цепь митохондрий и солевой стресс ................ 48
3
1.4 Роль транскрипционных факторов в регуляции экспрессии генов в условиях засоления .............................................................................................. 50
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................... 55
2.1 Цель и задачи исследования ......................................................................... 55
2.2 Объекты и методы исследования ................................................................. 56
2.2.1 Объекты исследования ............................................................................... 56
2.2.2 Экспериментальная постановка по моделированию солевого стресса . 56
2.2.3 Определение активности сукцинатдегидрогеназы .................................. 56
2.2.4 Выделение митохондрий из растительного материала ........................... 57
2.2.5 Определение активности сукцинатоксидазной системы ........................ 57
2.2.6 Определение количества белка .................................................................. 58
2.2.7 Выделение и очистка изоферментов сукцинатдегидрогеназы ............... 58
2.2.8 Электрофоретическое исследование сукцинатдегидрогеназы ............... 59
2.2.8.1 Электрофоретический анализ ................................................................. 59
2.2.8.2 Специфическое проявление изоферментов ........................................... 59
2.2.8.3 Определение гомогенности ферментных препаратов .......................... 59
2.2.9 Исследование кинетических особенностей регуляции изоферментов .. 59
2.2.10 Экстракция суммарной клеточной РНК и ДНК ..................................... 60
2.2.10.1 Выделение суммарной РНК .................................................................. 60
2.2.10.2 Выделение ДНК ..................................................................................... 60
2.2.10.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле ........................ 60
2.2.11 Реакция обратной транскрипции ............................................................. 61
2.2.12 Проведение ПЦР в реальном времени .................................................... 61
2.2.13 Бисульфитная модификация ДНК. .......................................................... 63
4
2.2.14 Анализ промоторов генов и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР ....................................................................................................................... 63
2.2.15 Проведение метил-специфичной ПЦР ................................................... 64
2.2.16 Анализ промоторной области генов на наличие сайтов связывания солезависимых факторов транскрипции. .......................................................... 64
2.2.17 Статистическая обработка данных ......................................................... 65
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ............................................... 66
3.1 Влияние солевого стресса на функционирование сукцинатдегидрогеназы 66
3.1.1 Влияние NaCl на активность фермента сукцинатдегидрогеназы в изолированных митохондриях. ........................................................................... 66
3.1.2 Очистка изоферментов сукцинатдегидрогеназы и изучение их кинетических характеристик .............................................................................. 68
3.1.2.1 Определение рH-оптимума изоферментов сукцинатдегидрогеназы. . 73
3.1.2.2 Определение константа Михаэлиса-Ментен и Vmax для полученных изоферментов СДГ ............................................................................................... 75
3.1.3 Влияние солевого стресса на митохондриальное дыхание и активность сукцинатоксидазы. ............................................................................................... 76
3.1.4 Изменение активности сукцинатдегидрогеназы в условиях засоления in
vivo ......................................................................................................................... 79
3.2 Влияние солевого стресса на регуляцию экспрессии генов СДГ ............. 81
3.2.1 Изменение экспрессионной активности генов, кодирующих каталитический димер СДГ в Zea mays и Triticum aestivum. ........................... 81
3.2.2 Влияние солевого стресса на изменение транскриптов генов мембраносвязанных субъединицы СДГ в листьях кукурузы и пшеницы ...... 87
5
3.3 Механизмы регуляции генетической активности генов сукцинатдегидрогеназы при действии засоления. ............................................ 91
3.3.1 Распределение специфичных сайтов взаимодействия факторов транскрипции в нуклеотидной последовательности промоторов генов сукцинатдегидрогеназы Zea mays L и Triticum aestivum L. .............................. 91
3.3.2 Анализ промоторов генов сукцинатдегидрогеназы на наличие CG-
островков .............................................................................................................. 95
3.3.3 Эпигенетические механизмы регуляции генов СДГ в листьях кукурузы, при воздействии хлорида натрия. ...................................................................... 98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................. 100
ВЫВОДЫ ........................................................................................................... 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................. 107
