Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и методы его выявления 14
1.2 Применение моноклональных и поликлональных антител для терапии синегнойной инфекции 24
1.3 Применение моноклональных антител для диагностики синегнойной инфекции 30
1.4 Заключение 35
Глава 2 Материалы и методы 36
2.1 Оборудование и материалы 36
2.1.1 Бактериальные штаммы и клеточные линии 36
2.1.2 Лабораторные животные 38
2.1.3 Антигены и антитела 38
2.1.4 Оборудование 38
2.1.5 Реактивы 39
2.2 Методы 40
2.2.1 Получение рекомбинантных вариантов экзотоксина А 40
2.2.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли 41
2.2.3 Иммуноблоттинг 42
2.2.4 Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител 42
2.2.5 Замораживание гибридных клеток 43
2.2.6 Культивирование гибридных клеток in vivo 43
2.2.7 Иммуноферментный анализ 44
2.2.8 Цитотоксический тест 46
2.2.9 Реакция нейтрализации цитотоксичности 47
2.2.10 Иммунодот вариант иммуноферментного анализа 47
2.2.11 Выращивание Pseudomonas aeruginosa (штамм PA 103) на питательных средах различного состава 48
2.2.12 Культивирование и хранение штаммов P. aeruginosa 48
2.2.13 Хроматографическая очистка моноклональных антител 50
2.2.14 Иммунизация животных 50
2.2.15 Конъюгирование антител с пероксидазой хрена 51
2.2.16 Выявление ЭТА в полимеразной цепной реакции 52
2.2.17 Статистические методы 53
Основная часть 54
Глава 3 Получение и оценка свойств моноклональных антител к ЭТА Pseudomonas aeruginosa 54
3.1 Получение рекомбинантных форм ЭТА 54
3.2 Получение первичных гибридных культур-продуцентов антител к экзотоксину А P. aeruginosa 56
3.3 Тестирование и отбор первичных гибридных культур 58
3.4 Тестирование МА в иммунодот варианте иммуноферментного анализа. 62
3.5 Изучение цитотоксичности рекомбинантных вариантов ЭТА 64
3.6 Определение токсиннейтрализующей активности моноклональных антител 66
3.7 Заключение 71
Глава 4 Применение моноклональных антител для выявления ЭТА 74
4.1 Взаимодействие моноклональных антител с растворённым антигеном 74
4.2 Сравнительная характеристика токсинообразования P. aeruginosa при культивировании на различных питательных средах . 76
4.3 Выявление экзотоксина А у клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa в тестах на культуре клеток 79
4.4 Применение МА для выявления ЭТА P. aeruginosa в иммуноферментном анализе 83
4.5 Выявление ЭТА P. aeruginosa в полимеразной цепной реакции 89
4.6 Сравнительная характеристика методов выявления ЭТА P. aeruginosa93
Заключение 97
Список литературы 102
