Введение
ГЛАВА 1. Обзор данных литературы. 19-76
1.1. Моноклональные антитела как инструмент изучения вирусных белков. 19
1.1.1. Моноклональные антитела: получение и основные свойства. 19
1.1.2. Исследование и картирование антигенных детерминант на вирусных белках с помощью МКА. 22
1.2. Филовирусы: вирусы Марбург и Эбола.
1.2.1. Классификация, морфология, организация генома, структура и функции белков. 25
1.2.2. Иммунитет при филовирусных инфекциях. 35
1.2.3. Вакцинный потенциал филовирусных белков. 39
1.2.4. МКА к филовирусам: получение, свойства и применение. 42
1.3. Флавивирусы: вирус Западного Нила (ВЗН). 43
1.3.1. Общая характеристика ВЗН 43
1.3.2. Структурные белки флавивирусов и белок Е ВЗН. 46
1.3.3. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН в изучении флавивирусов. 48
1.4. Ортопоксвирусы: ВНО, ВОВ, ВОК, ВЭм. 51
1.4.1. Краткая характеристика ортопоксвирусов. 51
1.4.2. Некоторые методы исследования ортопоксвирусных белков. 53
1.4.3. Мембранные белки ортопоксвирусов. 56
1.4.4. МКА против структурных белков ортопоксвирусов. 63
1.5. Использование рекомбинантных белков для изучения и картирования антигенных детерминант на вирусных белках. 67
1.6. Гибридомные МКА и рекомбинантные одноцепочечные, химерные и гуманизированные антитела на их основе. 69
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть (Материалы и методы). 77-95
2.1. Исходные материалы. 77
2.1.1. Материалы и реактивы. 77
2.1.2. Вирусные препараты. 77
2.1.3. Клеточные культуры и среды. 80
2.1.4. Сыворотки и иммуноглобулины . 80
2.1.5. МКА к вирусным белкам. 81
2.1.6. Рекомбинантные белки вирусов и рекомбинантные антитела. 82
2.2. Методы получения гибридом и приготовления МКА. 82
2.2.1. Иммунизация животных-доноров иммунных спленоцитов . 82
2.2.2. Получение гибридом. 83
2.2.3. Клонирование гибридом. 86
2.2.4. Криоконсервация клеточных линий. 86
2.2.5. Наработка значительных количеств МКА in vivo. 87
2.2.6. Методы очистки МКА. 87
2.2.7. Измерение концентрации белковых препаратов. 88
2.2.8. Определение класса и подкласса моноклональных иммуноглобулинов. 89
2.2.9. Приготовление конъюгатов антител с биотином. 89
2.3. Иммунологические методы. 89
2.3.1. Твердофазный иммуноферментный анализ. 89
2.3.2. Конкурентный иммуноферментный анализ. 90
2.3.3. Определение константы аффинности МКА. 92
2.3.4. Иммуноблот. 93
2.3.5. Реакция нейтрализации вируса in vitro. 94
2.3.6. Антителозависимый лизис инфицированных вирусом клеток. 94
2.3.7. Определение протективной активности МКА при пассивной
иммунизации животных. 94
2.4. Электрофорез. 94
2.5. Статистическая обработка результатов. 95
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение исследований. 96-246
3.1. Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ «Вектор» » за период с 1982 по 2007 годы. 96
3.2. Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител . 103
3.2.1. Исследование препаратов вирусов Марбург и Эбола, используемых для получения гибридом. 104
3.2.2. Получение коллекции гибридом, продуцирующих MICA к филовирусам, и изучение свойств гибридомных антител. 112
3.3. Использование МКА в изучении белков филовирусов, их антигенной структуры, биологической активности и иммуногенных свойств. 119
3.3.1. Применение специфических моноклональных и поликлональных антител для выявления перекрестно-реактивных антигенных детерминант на структурных белках филовирусов Марбург и Эбола. 119
3.3.2. Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 ВМ, на репродукцию вируса. 124
3.3.3. Определение с помощью моноклональных и поликлональных антител иммунодоминантных белков филовирусов, формирующих В-клеточный иммунный ответ. 130
3.4. Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител . 141-157
3.4.1, Использование моноклональных антител для сравнительного изучения иммуногенных и антигенных свойств белка VP35 вируса Эбола и его рекомбинантного аналога. 141
3.4.2. Изучение белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител. 153
3.5. Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов Марбург и Эбола, с использованием моноклональных антител, рекомбинантных белков и их фрагментов. 158
3.5.1. Топологическое картирование антигенных сайтов и эпитопов на белках NP, VP40 и VP35 вируса Марбург. 158
3.5.2. Картирование антигенных детерминант и эпитопов для МКА на аминокислотной последовательности белков VP35 филовирусов Марбург и Эбола. 164
3.6. Изучение перекрестного взаимодействия МКА против ортопоксвирусов с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами. 182
3.6.1. Определение видоспецифических эпитопов ВЭм и родоспецифических эпитопов ВНО, ВОВ, ВОК и ВЭм 183
3.6.2. Выявление перекрестной нейтрализующей активности МКА, реагирующих с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии (ген 129L) и натуральной оспы (ген A30L). 189
3.7. Исследование с использованием гибридомных МКА антигенных 201-245
взаимоотношений штаммов вируса Западного Нила, изолированных в России и за рубежом. 202
3.7.1. Получение и характеристика МКА, реагирующих с общими и дифференцирующими антигенными детерминантами ВЗН.
3.7.2. Изучение с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом. 213
3.8. Сравнительный анализ нейтрализующей активности гибридомных МКА 9Е2 и рекомбинантных одноцепочечных scFv 9Е2
и гуманизированных Fc-9E2 антител против белка . 230
Заключение.
Выводы.
Список используемой литературы.
