СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................................ 4
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................... 9
1.Система протеостаза клетки.......................................................................................................... 9
2.Строение малых белков теплового шока ................................................................................... 13
2.1. Структура α-кристаллинового домена sHsp....................................................................... 14
2.2. Строение C- и N-концевых участков sHsp ......................................................................... 16
2.2.1. Структура C-концевого участка. .................................................................................. 16
2.2.2. Структура N-концевого участка ................................................................................... 17
3.Строение высокомолекулярных комплексов sHsp человека.................................................... 20
4. Роль N-концевого участка в регуляции олигомерного состояния и шапероноподобной
активности sHsp................................................................................................................................ 24
5. Гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока.............................................. 26
6.Взаимодействие малых белков теплового шока с белками-партнерами ................................ 30
6.1. Комплекс HspB6 с белком 14-3-3 ........................................................................................ 30
6.2. Взаимодействие sHsp с белком-адаптером BAG3 ............................................................. 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................................... 37
1. Получение плазмид и генно-инженерных конструкции........................................................... 37
2. Приготовление компетентных клеток и их трансформация .................................................... 38
3.Экспрессия белков........................................................................................................................ 38
4.Выделение и очистка малых белков теплового шока ............................................................... 39
5. Очистка и выделение белков-партнеров .................................................................................... 42
6. Методы исследования структуры и свойств белков ................................................................. 43
6.1. Флуоресцентные методы исследования.............................................................................. 43
6.2. Измерение шапероноподобной активности малых белков теплового шока................... 44
6.3. Фосфорилирование HspB6 cAMP-зависимой протеинкиназой........................................ 44
7.Четвертичная структура и белок-белковые взаимодействия в гомо- и гетероолигомерах
малых белков теплового шока ........................................................................................................ 45
7.1. Анализ четвертичной структуры sHsp и α-кристаллиновых доменов............................. 45
7.2. Исследование белок-белковых взаимодействий в гетероолигомерных
комплексах sHsp........................................................................................................................... 46
7.3. Исследование олигомерного состояния α-кристаллиновых доменов методом
динамического светорассеяния................................................................................................... 47
7.4. Анализ олигомерного состояния α-кристаллиновых доменов методом химического
сшивания ....................................................................................................................................... 47
8. Некоторые аналитические методы.............................................................................................. 47
8.1. Определение концентрации белка по методу Бредфорда ................................................. 47
8.2. Электрофорез в присутствии мочевины по методу Перрье-Перри ................................. 48
8.3. Tricine-SDS электрофорез по методу Шаггера и фон Яагова........................................... 48
8.4. Нативный электрофорез....................................................................................................... 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................... 50
1. Получение препаратов белков..................................................................................................... 50
1.1. Выделение малых белков теплового шока ......................................................................... 50
1.1.1. Стандартный протокол выделения............................................................................... 50
1.1.2. Экспрессия и выделение HspB7 ................................................................................... 51
2. Анализ олигомерного состояния α-кристаллиновых доменов различных малых белков
теплового шока человека................................................................................................................. 54
3
3.Влияние N-концевого домена на встраивание α-кристаллиновых доменов в состав
олигомеров полноразмерных малых белков теплового шока...................................................... 58
4. Участие консервативного sRLFDQxFG мотива N-концевого домена в образовании гомо- и
гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока ................................................ 64
5.Влияние точечных мутаций S10F и P20L на физико-химические свойства HspB6............... 70
6. Особенности строения и свойства N-концевого домена HspB7 и HspB8............................... 78
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................. 88
ВЫВОДЫ............................................................................................................................................. 91
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ............................... 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................ 94
БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................... 104
Приложение 1.................................................................................................................................... 105
Приложение 2.................................................................................................................................... 106
Приложение 3.................................................................................................................................... 107
Приложение 4.................................................................................................................................... 108
Приложение 5.................................................................................................................................... 109
Приложение 6.................................................................................................................................... 110
Приложение 7.................................................................................................................................... 111
