Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение 7
3. Обзор литературы. Наночастицы как адъюванты
3.1. Введение. Классификация адъювантов по механизму их действия 9
3.2. Эмульсии 12
3.2.1. Коммерческие адъювантные препараты на основе эмульсий 13
3.2.1.1. Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле» 13
3.2.1.2. Адъюванты на основе эмульсий «масло в воде» 3.3. Липосомыи виросомы 16
3.4. Сапонины и ИСКОМЫ 19
3.5. Полимерные наночастицы 22
3.6. Неорганические наночастицы 24
3.7. Влияние размеров частиц адъювантов на свойства вакцин 25
3.8. Заключение 30
4. Обсуждение результатов 31
4.1. Введение 31
4.2. Методы исследования 32
4.3. Получение наночастиц из природных соединений 33
4.3.1. Получение наночастиц на основе тритерпеноидов бересты 33
4.3.1.1. Характеристика наночастиц из тритерпеноидов бересты 33
4.3.1.2. САНЧ из СТБ с мирамистином и олеиновой кислотой 34
4.3.1.3. Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и их стабильность 38
4.3.1.4. Стадии формирования сферических аморфных наночастиц
4.3.2. Получение наночастиц на основе дигидрокверцетина 43
4.3.3. Получение наночастиц на основе гликосфинголипидов 44
4.4. Исследование биологических свойств наночастиц 47
4.4.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами 47
4.4.1.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови 47
4.4.1.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови
4.4.1.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином 52
4.4.2. Исследование адъювантных свойств наночастиц 54
4.4.2.1. Экспериментальные вакцины против гепатита В 54
4.4.2.2. Экспериментальные вакцины против вируса гриппа 56
4.4.3. Исследование токсичности НЧ in vitro 59
4.4.3.1. МТТ-тест 60
4.4.3.2. Окрашивание трипановым синим 64
4.4.3.3. Оценка цитотоксичности с использованием проточной цитометрии 67
4.4.3.4. Выявление окислительного стресса 69
4.4.3.5. Оценка гемолитической активности 71
4.5. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения сферических
аморфных наночастиц 72 4.5.1. Установки для получения САНЧ из СТБ 72
4.5.2. Разработка методов контроля 4.5.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях 77
4.5.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ 78
4.5.3. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ 79
5. Экспериментальная часть 81
5.1. Материалы и методы 81
5.2. Получение наночастиц из природных соединений 83
5.2.1. Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты 83
5.2.1.1. САНЧ без модификатора по «стандартной» методике 83
5.2.1.2. САНЧ с модификатором (олеиновой кислотой или мирамистином) 83
5.2.1.3. САНЧ из СТБ, меченные 3-метоксибензантроном 84
5.2.1.4. Влияние рН среды на формирование САНЧ 84
5.2.1.5. Влияние состава СТБ на формирование САНЧ 85
5.2.1.6. Стадии формирования САНЧ 86
5.2.2. Получение НЧ на основе ДГК
5.2.2.1. Дисперсии дигидрокверцетина 86
5.2.2.2. Дисперсии ДГК с мирамистином 86
5.2.3. Получение НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина 87
5.2.3.1. Методика определения «зоны эквивалентности» 87
5.2.3.2. Отработка способа и порядка прибавления компонентов дисперсии 87
5.2.3.3. НЧ из ГСфЛ и мирамистина 88
5.2.3.4. НЧ из ГСфЛ и мирамистина с добавлением ДГК
5.3. Образцы для биологических испытаний адъювантной активности 88
5.4. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови
5.4.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови 89
5.4.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови 90
5.4.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином 91
5.5. Культивирование клеток 92
5.5.1. HeLa 92
5.5.2. Jurkat 92
5.6. Токсикологические исследования наночастиц in vitro 92
5.6.1. Оценка цитотоксичности наночастиц с помощью МТТ-теста 92
5.6.1.1. Использование адгезионной культуры клеток линии HeLa 92
5.6.1.2. Использование суспензионной культуры клеток линии Jurkat
5.6.2. Оценка жизнеспособности клеток методом окрашивания трипановым синим 93
5.6.3. Оценка цитотоксичности дисперсий с помощью цитофлуориметрии
5.6.3.1. Окрашивание клеток пропидий йодидом 94
5.6.3.2. Окрашивание клеток флуоресцеин диацетатом
5.6.4. Выявление окислительного стресса 95
5.6.5. Оценка гемолитической активности наночастиц 96
5.7. Разработка экспериментальных установок для получения САНЧ. Методы получения
САНЧ отличные от «стандартной» методики 96
5.7.1. Установка с дроссельным элементом смешения 96
5.7.2. Смеситель закрытого типа с мешалкой 97
5.7.3. Ультрафильтрация 97
5.7.4. Получение САНЧ многоступенчатым методом 97
5.8. Разработка методов контроля 98 5.8.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях 98
5.8.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ 98
5.9. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ 99
6. Выводы 100
7. Благодарности 102
8. Список литературы 103
