Введение
Глава 1. Метилирование ДНК в норме и при патологии (обзор литературы) 15
1.1. Феномен метилирования ДНК 15
1.1.1. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме 17
1.1.2. Профили метилирования 19
1.1.3. Ферменты метилирования 20
1.1.4. Метилирование генома как динамический процесс 22
1.1.5. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина 24
1.1.6. Методы анализа метилирования ДНК 28
1.2. Метилирование ДНК и наследственная патология 33
1.2.1. Общие представления об импринтинге 34
1.2.2. Механизмы геномного импринтинга 39
1.3. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов и канцерогенез 47
1.3.1. Молекулярные механизмы канцерогенеза 49
1.3.2. Гены-супрессоры опухолевого роста 50
1.3.3. Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл 53
1.3.4. Двухударная модель канцерогенеза 57
1.3.5. Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез 58
Глава 2. Материалы и методы 65
2.1. Характеристика пациентов 65
2.2. Забор крови и операционного материала 66
2.3. Выделение геномной ДНК 66
2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции и электрофорез при проведении блот-гибридизации 67
2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом 68
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПНР) 69
2.6.1. Микросателлитный анализ делеций и ОРД при СПВ и СА 69
2.6.2. Микросателлитный анализ ОРД при СВБ и нефробластоме 70
2.6.3. Микросателлитный анализ делеций и ПГ при ретинобластоме 70
2.6.4. Полимеразная цепная реакция кодирующих районов гена RB1 71
2.6.5. Метил-специфическая ПЦР при СПВ и СА 73
2.6.6. Метил-чувствительная ПЦР CpG-островков генов IGF2 \\LIT1 при СВБ 75
2.6.7. Метил-чувствительная ПЦР фрагментов CpG-островков района X(q27.3-q28) приСМБиНСУО 76
2.6.8. Метод метил-чувствительной ПЦР промоторных районов генов-супрессоров 77
2.7. Детекция точковых мутаций методом SSCP 78
2.8. Анализ гетеродуплексов (НА) 79
2.9. Автоматическое секвенирование 79
2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК 80
Глава 3. Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана как модель изучения патологии импринтинга 81
3.1. Клиническая характеристика синдрома Прадера-Вилли 81
3.2. Клиническая характеристика синдрома Ангельмана 82
3.3. Молекулярная организация хромосомного района 15(ql 1 - ql3) 82
3.4. Формы молекулярной патологии, вызывающие СПВ и СА 85
3.4.1. Делеции критического района 15(qll - ql3) 85
3.4.2. Однородительская дисомия , 87
3.4.3. Мутации центра импринтинга 90
3.5. Гены-кандидаты и их возможное участие в формировании фенотипических проявлений СПВ и СА 97
3.5.1. Гены-кандидаты для СПВ 97
3.5.2. Гены-кандидаты для СА 102
3.6. ДНК-диагностика СПВ и СА 104
3.6.1. Анализ аллельного метилирования локусов хромосомного района 15(ql l-ql3) 104
3.6.1.1. Блот-гибридизационный анализ с использованием метилчувствительных рестриктаз 105
3.6.1.2. Бисульфитная модификация ДНК и метилспецифическая ПЦР 107
3.6.2. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов хромосомного района 15(qll-ql3) 110
Глава 4. Синдром Видемана-Беквита и нефробластома как модель потери импринтинга 114
4.1. Клинико-генетическая характеристика синдрома Видеманна-Беквита 114
4.2. Молекулярная организация импринтированного района хромосомы 11р15.5 и гены, вовлеченные в формирование фенотипических признаков СВБ 116
4.3. Тонкая структурно-функциональная организация района, содержащего гены HJ9uIGF2 120
4.4. Молекулярная патология, приводящая к СВБ 122
4.5. Молекулярная диагностика СВБ и нефробластомы 124
Глава 5. Синдром Мартина-Белл, неспецифическая умственная отсталость FRAXE и метилирование районов экспансии тринуклеотидных повторов 130
5.1. Клинико-генетическая характеристика и молекулярно-генетические основы синдрома Мартина-Белл 130
5.1.1. Клиническая характеристика синдрома Мартина-Белл 130
5.1.2. Цитогенетические основы СМБ 131
5.1.3. Особенности наследования СМБ. Парадокс Шермана 131
5.1.4. Молекулярно-генетические основы СМБ 133
5.2. Клиническая характеристика, цитогенетические и молекулярно генетические основы УО FRAXE и FRAXF 137
5.2.1. Клиническая характеристика и цитогенетические основы УО FRAXE и FRAXF 137
5.2.2. Молекулярно-генетические основы УО FRAXE и FRAXF 138
5.3. Роль импринтинга и эффекта положения в развитии СМБ и УО FRAXE 139
5.4. Гиперметилирование амплифицированных CGG-повторов 141
5.4.1. Механизмы гиперметилирования CGG-повторов 141
5.4.2. Реализация эффектов метилирования CGG-повторов 143
5.5. Методы ДНК-диагностики СМБ, УО FRAXE и FRAXF 144
5.5.1. ДНК-диагностика СМБ 144
5.5.2. ДНК-диагностика УО FRAXE и FRAXF 150
5.5.3. Детекция экспансии тринуклеотидного повтора CGG методом блот-гибридизации 151
5.5.4. Анализ метилирования CpG-островка гена FMR1. 154
5.5.4.1. Совместный анализ метилирования CpG-островка FMR1 и экспансии CGG-повтора 154
5.5.4.2. Изолированный тест на метилирование с использованием блот-гибридизации 155
5.5.4.3. Анализ метилирования с использованием ПНР 156
5.5.5. Совместный анализ метилирования CpG-островков, прилежащих к ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF 162
5.5.6. Сравнительный анализ подходов к ДНК-диагностике СМБ и УО FRAXE Современный протокол лабораторной диагностики СМБ 166
Глава 6. Вклад эпигенетических нарушений в генез ретинобластомы 169
6.1. Клинико-генетическая характеристика ретинобластомы 169
6.2. Структура и функция гена RB1 170
6.3. Роль Р В1 в регуляции клеточного цикла 172
6.4. Молекулярная патология в ретинобластомах 175
6.4.1. Структурные мутации TQH&RBI в спорадических ретинобластомах 175
6.4.2. Потеря гетерозиготносте 180
6.4.3. Профиль метилирования генов-супрессоров в ретинобластомах 182
6.5. Алгоритм проведения ДНК-диагностики при ретинобластоме 190
Глава 7. Профиль метилирование генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы и эпителиальных дисплазиях шейки матки 192
7.1. Профиль метилирования генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы 192
7.2. Профиль метилирования генов-супрессоров в эпителиальных дисплазиях шейки матки 197
7.3. Возможность и необходимость разработки протоколов для ранней ДНК диагностики опухолеобразования 202
Общее заключение 204
Выводы 212
Список литературы 214
