Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 Введение 13
1.2 Концепция тканевой инженерии 15
1.3 Основные тренды и проблемы в разработке носителей
1.3.1 носители на основе естественных материалов 17
1.3.2 Носители на основе синтетических материалов
1.4 Основные типы клеток, совмещаемые с носителями с целью создания графтов сосудов 23
1.5 Способы совмещения различных носителей и клеток 25
1.6 «Безматриксное» изготовление тканеинженерных кровеносных сосудов 33
1.7 Тканевая инженерия кровеносных сосудов in vivo из грануляционной ткани 35
1.8 Использование биореакторов в тканевой инженерии кровеносных сосудов малого калибра 36
1.9 Заключение 37
2. Материалы и методы исследований 40
2.1 Создание основы тканеинженерного сосуда (носителя клеток) методом
децеллюляризации артерии пуповины человека 40
2.1.1 Получение материала 40
2.1.2 Поиск эффективного способа децеллюляризации артерий пуповины 40
2.1.3 Оригинальная методика децеллюляризации артерий пуповины 41
2.2 Морфологическое исследование децеллюляризованных артерий пуповины з
2.2.1 Изготовление микропрепаратов артерий для гистологического и иммуногистохимического исследования 42
2.2.2 Гистологическое исследование децеллюляризованных артерий пуповины 43
2.2.3 Иммуногистохимическое исследование децеллюляризованных артерий пуповины... 43
2.3 Определение содержания и состава нуклеиновых кислот в децеллюляризованных
артериях 44
2.3.1 Окрашивание децеллюляризованных артерий dapi 44
2.3.2 Определение содержания днк в децеллюляризованных артериях 45
2.3.3 Определение содержания и сохранности рнк в децеллюляризованных артериях 45
2.4 Хранение децеллюляризованных артерий 45
2.4.1 Криоконсервация децеллюляризованных артерий 45
2.4.2 Хранение децеллюляризованных артерий без замораживания 45
2.5 Изучение механических свойств артерий пуповины человека до и после
децеллюляризации 45
2.5.1 Группы исследования 45
2.5.2 Оценка механической прочности децеллюляризованных артерий пуповины человека 46
2.5.3 Изучение упруго-эластических свойств децеллюляризованных артерий пуповины человека 46
2.5.4 Устойчивость к прорезыванию шовным материалом 47
2.5.5 Определение площади поперечного сечения и толщины сосудистой стенки
2.6 Тест на стерильность децеллюляризованных сосудистых кондуитов 48
2.7 Посев клеток на децеллюляризованные артерии пуповины (рецеллюляризация)
2.7.1 культуральная среда и условия культивирования 49
2.7.2 Выделение и экспансия мезенхимных стволовых клеток 49
2.7.3 Определение эффективности клеточного засевания и оптимальной плотности посева децеллюляризованных артерий пуповины 50
2.7.4 Отработка различных вариантов улучшения доставки клеток на носитель 51
2.7.5 Подготовка клеток к рецеллюляризации, засевание клеток на децеллюляризованные артерии 52
2.7.6 Устройство биореактора 52
2.7.7 Культивирование тканеинженерных сосудов в статичных условиях и с применением оригинального проточного биореактора 54
2.7.8 Оценка концентрации клеток на матриксе, оценка их жизнеспособности 55
2.8 Изучение тканеинженерных сосудов в экспериментах in vivo 55 2.8.1 лабораторные животные, использованные в работе 55
2.8.2 Характеристика имплантатов 56
2.8.3 Имплантатация исследуемых сосудов 57
2.8.4 Выведение животных из эксперимента 58
2.9 Статистический анализ 59
3. Результаты 60
3.1 Выделение артерий из пуповины, макроскопическая характеристика нативных артерий 60
3.2 Результат апробации различных способов децеллюляризации 60
3.3 Макроскопическая характеристика, результаты гистологического и иммуногистохимическго исследования децеллюляризованных артерий пуповины человека 61
3.4 Результаты исследования содержания нуклеиновых кислот в децеллюляризованных артериях 64
3.5 Результаты исследования механической прочности испытуемых сосудов 65
3.6 Результаты исследования упруго-эластических свойств испытуемых сосудов 66
3.7 Результаты определения устойчивости к прорезыванию шовным материалом испытуемых сосудов 68
3.8 Результаты определения размеров сосудистой стенки 68
3.9 Тест на стерильность децеллюляризованных сосудистых кондуитов 69
3.10 Результаты испытаний различных способов доставки клеток на носитель 69
3.10.1 Выявление оптимального количества клеток в клеточной суспензии 69
3.10.2 Результаты статичного засевания децеллюляризованных артерий 71
3.10.3 Результаты доставки клеток с помощью центробежной силы 71
3.10.4 Результаты доставки клеток с помощью разницы давлений 3.11 результаты рецеллюляризации в проточном биореакторе по сравнению со статичным культивированием 73
3.12 Результаты имплантации графтов in vivo 74
4. Обсуждение 82
4.1 Преимущества использования децеллюляризованных артерий пуповины в качестве основы тканеинженерого сосуда малого калибра 82
4.2 Поиск оптимального способа децеллюляризации артерий пуповины 83
4.3 Децеллюляризованные артерии пуповины сохраняют свои механические свойства84
4.4 Засевание клеток на децеллюляризованные артерии пуповины 86 4.5 использование проточного биореактора улучшает результаты рецеллюляризвации.. 88
4.6 Имплантация экспериментальных сосудов в аорту крыс 89
4.7 Дальнейшие перспективы исследования 91
Заключение 92
Выводы 97
Практические рекомендации
