Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Инсулин и инсулиновые рецепторы в ЦНС 11
1.2. Инсулиновая сигнальная система в ЦНС 14
1.3. Функциональное значение инсулина в головном мозге 20
1.3.1. Роль инсулина в регуляции гомеостаза глюкозы и пищевого поведения 20
1.3.2. Инсулин как ростовой фактор 22
1.3.3. Нейромодуляторные эффекты инсулина 23
1.3.4. Влияние инсулина на когнитивные функции 23
1.3.5. Нейропротекторное действие инсулина 24
1.4. Свободнорадикальное окисление биомолекул и его биологическая роль в мозге .26
1.5. Антиоксидантная система и особенности ее функционирования в ЦНС 33
1.6. Редокс-зависимые сигнальные пути 37
1.7. Механизмы патогенеза ишемии головного мозга 38
1.8. Экспериментальные модели ишемического повреждения головного мозга 45
1.9. Предпосылки использования инсулина для терапии ишемии головного мозга. Интраназальный способ доставки 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Материалы 51
2.2. Экспериментальные модели индукции окислительного стресса на первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс in vitro 51
2.2.1. Выделение первичной культуры нейронов коры головного мозга крыс 51
2.2.2. Индукция окислительного стресса добавлением перекиси водорода 52
2.2.3. Модель депривации глюкозы и кислорода in vitro 53
2.3. Экспериментальная модель глобальной двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс с гипотензией и реперфузией 53
2.4. Метод определения жизнеспособности нейронов первичной культуры коры головного мозга крыс (МТТ-тест) 55
2.5. Определение активности каспазы-3 55
2.6. Метод определения образования активных форм кислорода в нейронах первичной культуры коры головного мозга крыс 55
2.7. Определение наличия специфических белков методом иммуноблоттинга 56
2.8. Определение уровня мембранного потенциала митохондрий нейронов первичной культуры коры головного мозга крыс методом проточной цитометрии 58
2.9. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, совмещенная с обратной транскрипцией 58
2.9.1. Выделение тотальной РНК 58
2.9.2. Обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией 59
2.9.3. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени 59
2.9.4. Анализ данных полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени 60
2.10. Изучение уровня продуктов перекисного окисления липидов 61
2.10.1. Выделение липидов из тканей животных по методу J. Folch 61
2.10.2. Метод количественного определения диеновых и триеновых конъюгатов 61
2.10.3. Метод количественного определения оснований Шиффа 62
2.10.4. Метод определения содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой 2.11. Выделение субклеточных фракций 62
2.12. Определение активности супероксиддисмутазы 63
2.13. Определение активности Na+/K+-АТФазы 64
2.14. Метод определения уровня общего глутатиона 64
2.15. Статистическая обработка данных 65
Глава 3. Результаты исследования 66
3.1. Изучение механизмов защитного действия инсулина на нейроны первичной культуры коры головного мозга крыс, подвергнутые действию перекиси водорода in vitro 66
3.1.1. Исследование защитного действия инсулина на нейроны коры мозга крыс, подвергнутые действию перекиси водорода in vitro 66
3.1.2. Изучение влияния инсулина на генерацию активных форм кислорода при добавлении перекиси водорода в нейронах коры мозга крыс in vitro 68
3.1.3. Изучение механизмов, лежащих в основе защитного действия инсулина, в динамике развития окислительного стресса в нейронах коры мозга крыс in vitro 71
3.1.4. Исследование влияния ингибиторов PI-3-К/Akt- и MEK1/2 / ERK1/2 –путей и активатора AMPK на защитный и антиоксидантный эффекты инсулина в условиях окислительного стресса, индуцированного H2O2, на нейронах коры мозга крыс 83
3.2. Исследование защитного действия инсулина и его механизмов на нейроны первичной культуры коры головного мозга крыс в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro 86
3.2.1. Изучение защитного и антиоксидантного действия инсулина на нейроны коры головного мозга крыс в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro 87
3.2.2. Исследование влияния инсулина на активность протеинкиназ Akt, GSK3, ERK1/2 и уровень Bax и Bcl-2 в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro на нейронах коры головного мозга крыс 89
3.3. Анализ механизмов действия инсулина, вводимого интраназально, при двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс с гипотензией и реперфузией 94
3.3.1. Изучение влияния инсулина, вводимого интраназально, на уровень продуктов перекисного окисления липидов в коре мозга крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 94
3.3.2. Исследование влияния инсулина, вводимого интраназально, на активность и экспрессию Na+/K+-АТФазы в коре мозга и гиппокампе крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 95
3.3.3. Исследование влияния инсулина при интраназальном введении на уровень некоторых компонентов защитных, в том числе антиоксидатной, систем в коре мозга крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 99
3.3.4. Изучение влияния инсулина при интраназальном введении на активность сигнальных путей в коре мозга и гиппокампе крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 102
Глава 4. Обсуждение результатов 109
Заключение 121
Выводы 122
Список сокращений 123
Список литературы 124
