Введение
2 Обзор литературы 12
2.1 Принятые классификации гликозидгидролаз 12
2.2 Механизмы действия гликозидгидролаз 15
2.3 Методы изучения механизмов ферментативных реакций 19
2.3.1 Спектрофотометрический метод определения скорости ферментативных реакций 19
2.3.2 Метод ЯМР-спектроскопии и его применение в биохимических исследованиях 20
2.3.3 Зависимость реакционной способности реагентов от их структуры 22
2.4 Ферментативный синтез гликозидной связи 26
2.4.1 Синтез гликозидной связи гликозилтрансферазами и гликозидгидролазами 26
2.4.2 Гликозилсинтазы 29
2.4.3 Региоселективность гликозидгидролаз и способы её изменения 32
2.5 Альфа-галактозиды – природные субстраты -галактозидаз 34
2.6 Альфа-галактозидазы микроорганизмов 36
3 Экспериментальная часть 39
3.1 Материалы и реагенты 39
3.2 Субстраты 39
3.3 Штаммы и плазмиды 40
3.4 Трансформация плазмид 40
3.5 Выделение рекомбинантной -галактозидазы дикого типа и её мутантных форм 41
3.6 Методы измерения гидролитической активности -галактозидазы из Thermotoga maritima 43
3.7 Определение концентрации белка 44
3.8 Методы определения гомогенности и молекулярной массы ферментов 44
3.9 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой -галактозидазой 45
3.10 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза мелибиозы, раффинозы и стахиозы, катализируемой TmГалА-ДТ 45
3.11 Исследование влияния рН на гидролитическую активность и стабильность рекомбинантных ферментов 46
3.12 Исследование влияния температуры на гидролитическую активность и стабильность TmГалА-ДТ 47
3.13 Анализ стереохимии продуктов ферментативного гидролиза п-НФГ, катализируемого рекомбинантными ферментами, методом ЯМР 1Н спектроскопии 47
3.14 Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза, катализируемой рекомбинантными ферментами 48
3.15 Определение влияния внешних нуклеофилов на гидролитическую активность ферментных препаратов 49
3.16 Метод тонкослойной хроматографии 50
3.17 Выделение и идентификация п-НФ-дигалактозидов, полученных в реакции трансгликозилирования, катализируемой TmГалА-ДТ 50
3.18 Анализ реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами -галактозидазы 51
3.19 Определение рН-оптимума реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами -галактозидазы 51
4 Результаты и обсуждение 53
4.1 Получение и характеристика рекомбинантной -галактозидазы из T. maritima MSB8 и её мутантных форм D327G и D387G 53
4.2 Установление механизма реакции гидролиза, катализируемой ТмГалА 58
4.2.1 Сравнение первичных аминокислотных последовательностей ферментов, гомологичных ТмГалА 58
4.2.2 Стереохимический результат действия -галактозидазы из T. maritima.59
4.2.3 Каталитические свойства исследуемых ферментов 61
4.2.3.1 Анализ кинетических параметров реакций гидролиза, катализируемых ТмГалА-ДТ, ТмГалА-D327G и ТмГалА-D387G 61
4.2.3.2 Влияние внешнего нуклеофила на скорость реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами 66
4.2.3.3 Зависимость скорости реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой исследуемыми ферментами, от рН 72
4.2.4 Определение скорость-лимитирующей стадии реакций гидролиза п НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами 74
4.4 Изучение реакции трансгликозилирования, катализируемой ТмГалА 79
4.4.1 Исследование трансгликозилирующей активности ТмГалА-ДТ 79
4.4.2 Рациональный дизайн и характеристика мутантных форм ТмГалА 81
5 Основные результаты и выводы 88
6 Список сокращений 91
Список литературы 93
Приложение А. Сравнение первичных аминокислотных последовательностей -галактозидаз GH36 семейства 109
