Введение
1. Обзор литературы 17
1.2 Эпидемиология ротавирусной инфекции 20
1.3 Патогенез ротавирусной инфекции 21
1.4 Профилактика ротавирусной инфекции 31
1.4.1 Живые аттенуированные противоротавирусные вакцины 31
1.4.2 Кандидатные вакцины на основе инактивированных ротавирусов 37
1.4.3 Кандидатные противоротавирусные вакцины на основе рекомбинантных белков 42
1.5.1 Флагеллин бактерии рода Salmonella 42
1.5.2 CRM197 - нетоксичный вариант дифтерийного токсина 45
1.6 Гибридные белки, содержащие фрагменты белков капсида VP6, VP8 ротавируса группы А в качестве активного агента кандидатной вакцины для профилактики ротавирусной инфекции 52
2. Материалы и методы 55
2.1 Плазмидная ДНК рЕТ-28а(+) 55
2.2 Бактериальные штаммы 56
2.3 Штаммы вируса 56
2.4 Лабораторные животные 57
2.5 Реакции ферментативной модификации ДНК 57
2.5.1 Синтез последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 57
2.5.2 Амплификация генов vp6vp8 и flicvp6vp8 58
2.5.4 Лигирование фрагментов плазмидной ДНК 60
2.6 Микробиологические методы 60
2.6.1 Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации 60
2.6.2 Трансформация бактериальных клеток 61
2.6.3 Скрининг рекомбинантн ых клонов на наличие тре буемой плазмидной ДНК 61
2.6.4 Индукция экспрессии генов, кодирующих гибридные рекомбинантные белки 62
2.6.5 Автоиндукция экспрессии 0,2% лактозой по методу Штудиера 63
2.7 Анализ и очистка нуклеиновых кислот 63
2.7.1 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 63
2.7.2 Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля 63
2.7.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 64
2.7.4 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК по методу Сенджера 65
2.8 Анализ и очистка рекомбинантных белков 67
2.8.1 Электрофорез белков в денатурирующих условиях по Леммли 67
2.8.2 Определение концентрации белка по методу Лоури 67
2.8.3 Получение и отмывка телец включения 69
2.8.4 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография 70
2.8.5 Гель-фильтрация 71
2.8.6 Определение остаточных белков штамма-продуцента 71
2.8.7 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента 72
2.8.8 Определение остаточных эндотоксинов 73
2.8.9 Расчет алифатического индекса 74
2.8.10 Western-blotting 74
2.8.11 Масс-спектрометрический анализ 75
2.9 Иммунологические методы 76
2.9.1 Определение иммуногенных свойств рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 76
2.9.2 Определение титра антител в сыворотках иммунизированных животных 77
2.9.3 Определение титра антител к антигенам ротавируса в сыворотках крови иммунизированных животных 78
2.9.4 Реакция нейтрализации вируса в культуре клеток 80
2.9.5 Исследование иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197 81
2.9.6 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 82
2.9.7 Определение ротавирусного антигена методом иммуноферментного анализа 85
2.9.8 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 87
2.10 Статистический анализ полученных результатов 89
2.11 Компьютерные методы анализа данных 89
3. Результаты 91
3.1 Получение белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 91
3.1.1 Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 91
3.1.2 Создание нуклеотидных последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 97
3.1.3 Создание и анализ плазмидных ДНК pET-28a(+)-vp6vp8 и pET-28a(+)-flicvp6vp8 и штаммов E.coli для их амплификации 98
3.1.4 Создание штаммов-продуцентов гибридных белковVP6VP8 и FliCVP6VP8 101
3.1.5 Индукция экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 и оценка локализации гибридных белков в клетках штаммов-продуцентов 102
3.1.6 Очистка гибридных рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 111
3.1.7 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 115
3.1.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 119
3.1.9 Определение остаточного белка штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 120
3.1.10 Определение остаточных эндотоксинов штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 122
3.2 Получение и характеристика рекомбинантного белка CRM197 122
3.2.1 Расчет алифатического индекса и индекса GRAVY для рекомбинантного белка CRM197 123
3.2.2 Индукция экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный CRM97 123
3.2.3 Очистка рекомбинантного белка CRM197 с использованием металлоаффинной хроматографии 137
3.2.4 Диализ препарата высокоочищенного белка CRM197 138
3.2.5 Определение подлинности рекомбинантного белка CRM197 138
3.2.6 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного белка CRM197 139
3.2.7 Определение остаточных белков штамма-продуцента 142
3.2.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента 142
3.2.9 Определение содержания бактериального липополисахарида 143
3.3 Результаты исследования рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro 144
3.3.1 Иммуногенная активность рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 144
3.3.2 Определение титра антител к ротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 148
3.3.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 150
3.3.4 Определение иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197 153
3.3.5 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 155
3.3.6 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 162
4. Обсуждение результатов 169
4.1 Введение 169
4.2 Получение рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 170
4.2.1 Молекулярный дизайн и клонирование последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 в плазмиде pET-28a(+) 170
4.2.2 Динамика биосинтеза рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в клетках E.coli 172
4.2.3 Очистка гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 с помощью металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации 175
4.2.4 Контроль качества полученных образцов рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 177
4.3 Получение и характеристика рекомбинантного белка-адъюванта CRM197 178
4.4 Анализ результатов, полученных при изучении рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro 180
4.4.1 Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 180
4.4.2 Титр антител к ротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 184
4.4.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 185
4.4.4 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 186
4.4.5 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 188
Заключение 190
Выводы 193
Список литературы 194
Список условных сокращений и обозначений 219
