Введение
1.Обзор литературы 19
1.1.Инсулиновая сигнализация и ее регуляция 19
1.1.1. Физиологическое состояние инсулиновой сигнализации 20
1.1.2.Обратные связи и регуляция инсулиновой сигнализации 26
1.2.Ассоциация ожирения и латентного воспаления жировой ткани .28
1.2.1.Пусковые механизмы развития воспаления при ожирении 28
1.2.2.Изменения иммунофенотипа жировой ткани при ожирении .32
1.2.3.Ожирение и МСК ЖТ .35
1.3.ИЛ-4 как перспективный терапевтический агент для коррекции инсулиновой резистентности жировой ткани .36
1.3.1.ИЛ-4: сигнализация и физиологические эффекты .38
1.3.2.ИЛ-4 и жировая ткань .39
1.4.Генная терапия .40
1.4.1.Плазмидная генная терапия .42
1.4.2.Вирусная генная терапия 44
1.5.Заключение .46
2.Материалы и методы .47
2.1.Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование .47
2.2.Иммуногистохимическое исследование биоптатов жировой ткани пациентов 49 2.3.Выделение МСК из жировой ткани пациентов .51
2.4.Культивирование, заморозка и адипогенная дифференцировка МСК ЖТ пациентов 52
2.5.Оценка пролиферации МСК ЖТ пациентов 54
2.6.Оценка распределения по фазам клеточного цикла МСК ЖТ пациентов 54
2.7.Выделение фракции тотальной РНК из клеток .55
2.8.Проведение количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени .56
2.9.Оценка адипогенной дифференцировки МСК ЖТ пациентов 57
2.10.Культивирование преадипоцитов мыши 3T3-L1 и их адипоцитарная дифференцировка 58
2.11. Моделирование метаболического стресса на зрелых адипоцитах 3T3-L1 .59
2.12.Коррекция воспалительного статуса и инсулиновой чувствительности адипоцитов с помощью рекомбинантного ИЛ-4 61
2.13.Создание лентивирусной конструкции, кодирующей ИЛ-4 .61
2.14.Лентивирусная трансдукция зрелых адипоцитов и контроль наработки трансгена .63
2.15.Оценка инсулин-индуцируемого захвата радиоактивных аналогов [3Н]-2-дезоксиглюкозы 64
2.16.Иммуноблоттинг 65
2.17.Иммуноцитохимическое исследование ядерной транслокации транскрипционного фактора STAT6 .65
2.18.Анализ изменения протеома зрелых адипоцитов 3T3-L1 при кратком и длительном действии ИЛ-4 .67
2.19. Статистический анализ 68
3.Результаты 70
3.1.Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование .70
3.2.Подкожная и сальниковая жировые ткани пациентов с ожирением и СД2Т имеют в своем составе гипертрофированные адипоциты 71
3.3.Подкожная и сальниковая жировые ткани пациентов с ожирением и СД2Т имеют высокую степень инфильтрации CD68-позитивными клетками 72
3.4.Подкожная и сальниковая жировые ткани пациентов с ожирением и СД2Т не имеют статистически значимых различий по числу макрофагов, экспрессирующих CCR7 74
3.5.Подкожная и сальниковая жировые ткани пациентов с ожирением и СД2Т имеют сниженное количество макрофагов, экспрессирующих CD206 76
3.6.МСК подкожной жировой ткани пациентов с СД2Т имеют ухудшенную динамику пролиферативной активности по сравнению с МСК подкожной жировой ткани пациентов с НГТ с 24 до 96 часов наблюдения 78
3.7.МСК сальниковой жировой ткани пациентов с СД2Т имеют ухудшенную динамику пролиферативной активности по сравнению с МСК сальниковой жировой ткани пациентов с НГТ на 72 и 96 часах наблюдения 78
3.8.Активность стресс-активируемой киназы JNK повышена в адипоцитах, полученных из МСК ЖТ пациентов с СД2Т .80
3.9.МСК ЖТ пациентов с СД2Т имеют пониженную способность к адипогенной дифференцировке по сравнению с МСК ЖТ пациентов с НГТ 81
3.10.Влияние агентов, индуцирующих метаболический стресс, на инсулиновую чувствительность и воспалительный статус зрелых адипоцитов 85
3.11. Обработка инсулинорезистентных зрелых адипоцитов 3T3-L1 рекомбинантным ИЛ-4 в концентрации 50 нг/мл восстанавливает инсулиновую чувствительность зрелых адипоцитов .88
3.12.Обработка дифференцирующихся преадипоцитов 3T3-L1 не влияет на эффективность адипоцитарной дифференцировки 95
3.13.Зрелые адипоциты 3T3-L1, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим ИЛ-4, экспрессируют и секретируют ИЛ-4 .98
3.14.Трансдукция зрелых адипоцитов 3T3-L1 защищает зрелые адипоциты 3T3-L1 от формирования липид-индуцированной инсулиновой резистентности .102
3.15.Обработка зрелых адипоцитов ИЛ-4 в условиях липид-индуцированной инсулиновой резистетности стимулирует транслокацию транскрипционного фактора STAT6 в ядро .105
3.16.Анализ изменения протеома зрелых адипоцитов 3T3-L1 при кратком и длительном действии ИЛ-4 .108
4.Обсуждение результатов 111
4.1.Инсулиновая резистентности и латентное воспаление жировой ткани как следствия нарушения пролиферативного потенциала МСК ЖТ 111
4.2.Моделирование метаболического стресса на зрелых адипоцитах 3T3 L1 114
4.3. Коррекция инсулиновой резистентности с использованием рекомбинантного ИЛ-4 117
4.4.Коррекция инсулиновой резистентности с использованием лентивируса, кодирующего ген ИЛ-4 120
4.5.Действие ИЛ-4 на зрелые адипоциты связано с активирующим фосфорилированием и ядерной транслокацией транскрипционного фактора STAT6 122
Заключение .125
Выводы 128
Список литературы .129
