Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Проблема обнаружения белков в растворах с низкими концентрациями 12
1.2 Методы исследования белков на уровне отдельных молекул 17
1.3 Возможности АСМ при исследовании отдельных биомакромолекул 31
1.3.1 Контактные и динамические режимы визуализации АСМ 31
1.3.2 Режим силовой спектроскопии 35
1.3.3 Расширение возможностей АСМ при комбинации с другими методами для исследования биомакромолекул 42
1.4 Применение АСМ в медицине 43
1.5 Конструкция АСМ-чипа: предпосылки 50
1.5.1 Материалы для изготовления чипов 50
1.5.2 Принцип фишинга целевых белков 54
1.5.3 Формат АСМ-чипов 56
Глава 2. Материалы, методы и разработанные методики фишинга 60
2.1 Атомно-силовые микроскопы 60
2.1.1 Принцип получения АСМ-изображений в режиме топографии 64
2.1.2 Обработка результатов АСМ-сканирования в режиме топографии 65
2.1.3 АСМ-измерения в режиме PicoTREC 67
2.2 Вспомогательное лабораторное оборудование 68
2.3 Краткая характеристика белков, используемых в качестве целевых при АСМ-фишинге 69
2.4 Антитела, аптамеры, реактивы 71
2.5 Методика сорбции белков на свежесколотую слюду 75
2.6 Реализованные схемы фишинга 77
2.7 Дизайн АСМ-чипов 80
2.7.1 АСМ-чипы на основе слюды для фишинга в объеме анализируемого раствора 80
2.7.2 Методика формирования на поверхности АСМ-чипа массива из сенсорных зон 81
2.7.3 АСМ-чипы на основе ВОПГ для фишинга в проточном режиме 84
2.7.4 Определение размера сенсорной зоны на поверхности 85
2.8 Методики активации поверхности и иммобилизации биомолекул лигандов 87
2.8.1 Методика ковалентной иммобилизации белков на поверхность чипа с применением кросс-линкеров EDC и NHS 87
2.8.2 Методика активации поверхности с помощью сукцинимидного кросс-линкера и последующей иммобилизации молекул лиганда на поверхность чипа 89
2.8.3 Модификация иммобилизованных антител 92
2.8.4 Модификация кантилевера с помощью gp120 для АСМ-измерения в режиме PicoTREC 93
2.9 Методики фишинга 94
2.9.1 Неспецифический необратимый (химический) фишинг 94
2.9.2 Неспецифический обратимый фишинг 95
2.9.3 Биоспецифический обратимый и необратимый фишинг 97
Глава 3. Результаты и обсуждение 100
3.1 Результаты предварительных и контрольных экспериментов 100
3.1.1 Результаты процедуры силанизации 100
3.1.2 Контроль чистоты используемых растворов 106
3.1.3 Визуализация белков на поверхности свежесколотой слюды 107
3.1.4 Результаты определения площади сенсорной зоны на поверхности АСМ-чипа и расчетная оценка чувствительности анализа 115
3.2 Результаты фишинга неспецифического необратимого (химического) 120
3.2.1 Химический фишинг авидина 120
3.2.2 Химический фишинг пероксидазы хрена (ПХ) 124
3.2.3 Химический фишинг: заключение 128
3.3 Результаты фишинга неспецифического обратимого 130
3.3.1 Результаты контрольных экспериментов 130
3.3.2 Результаты фишинга ЧСА 131
3.3.3 Результаты фишинга цитохрома b5 134
3.3.4 Результаты измерения заряда в ячейке для фишинга после ввода растворов 137
3.3.5 Фишинг неспецифический обратимый: обсуждение и заключение 139
3.4 Результаты биоспецифического обратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами 144
3.4.1 Результаты иммобилизации антител на поверхность чипа 144
3.4.2 Результаты биоспецифического обратимого и необратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами 145
3.4.3 Биоспецифический фишинг НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами: обсуждение и заключение 153
3.5 Результаты биоспецифического фишинга gp120 154
3.5.1 АСМ-визуализация после процедуры иммобилизации аптамера против gp120 в полуконтактном режиме 155
3.5.2 АСМ-визуализация иммобилизованного аптамера против gp120 в режиме PicoTREC 157
3.5.3 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами 158
3.5.4 АСМ-визуализация антител против gp120 в полуконтактном режиме 159
3.5.5 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными антителами 159
3.5.6 Оценка контрастности изображения молекул белка gp120, выловленного на АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами и АСМ-чип с иммобилизованными антителами 160
3.5.7 Биоспецифический фишинг gp 120: заключение 161
3.6 Результаты биоспецифического фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными аптамерами 163
3.6.1 АСМ-чипы с одним типом аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе 163
3.6.2 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: результаты контрольных экспериментов 167
3.6.3 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: обсуждение 170
3.6.4 Разработка критериев оценки АСМ-данных при использовании чипов с иммобилизованными аптамерами 171
3.6.5 АСМ-чипы с тремя типами аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе: определение чувствительности анализа 174
3.7 АСМ-чипы с иммобилизованными аптамерами для обнаружения HCVcoreAg в сыворотке крови человека 183
3.7.1 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: результаты 183
3.7.2 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: обсуждение и заключение 191
3.8 Анализ и обобщение полученных результатов 193
Заключение 198
Выводы 199
Список сокращений и условных обозначений 201
Библиография 202
Благодарности 214
