Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. История открытия и молекулярная структура цисплатина 13
1.2. Метаболизм цисплатина в клетке. Биохимические основы цитостатического действия цисплатина 14
1.2.1. Внутриклеточный транспорт и метаболизм цисплатина .14
1.2.2. Механизмы внутриклеточного ответа на повреждение ДНК, вызванное цисплатином 16
1.2.3. Репарация повреждений ДНК, вызванных цисплатином 16
1.2.4. Нарушения клеточного цикла и индукция апоптоза 19
1.3. Применение цисплатина в химиотерапии онкологических заболеваний и проблема резистентности .21
1.3.1. Биохимические и молекулярно-биологические механизмы развития устойчивости к цисплатину и пути ее преодоления 22
1.4. Биоинформатические подходы к идентификации генов человека, связанных с определенными биологические функциями в клетке 27
1.4.1. Эволюционная и сравнительная геномика, понятия ортолог и паралог .27
1.4.2. Биоинформатические подходы к идентификации ортологов и оценке эволюционных взаимодействий между генами 30
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Биоинформатические методы 32
2.1.1. Биоинформатический анализ баз данных модельных организмов .32
2.1.2. Методы идентификации ортологов эволюционно консервативных генов-кандидатов 32
2.1.3. Кластеризация и визуализация данных скриннинговых исследований .33
2.1.4. Функциональная аннотация генов 33
2.1.5. Анализ мутационного профиля использованных клеточных линий 34
2.2. Объекты исследования in vitro. Методы работы с эукариотическими клеткам 34
2.2.1. Клеточные линии и культивирование эукариотических клеток 34
2.2.2. Метод химической трансфекции эукариотических клеток миРНК .35
2.3. Оптические методы анализа 37
2.3.1. Анализ выживаемости клеток методом количественной флуориметрии 37
2.3.2. Анализ количества фокусов репарации методом иммунофлуоресцентной микроск 39
2.4. Анализ экспрессии мРНК методом ПЦР в реальном времени .40
2.5. Анализ экспрессии белка методом иммуноблотинга 42
2.5.1. Получение клеточных лизатов 42
2.5.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 43
2.5.3. Белковый перенос на PVDF мембрану, детекция и анализ 43
Глава 3. Результаты исследований 45
3.1. Поиск эволюционно консервативных генов кандидатов, вовлеченных в клеточный ответ на повреждение ДНК, с помощью модельных организмов 45
3.1.1. Идентификация генов-кандидатов в S. cerevisiae 45
3.1.2. Кластеризация генов S. cerevisiae со схожим профилем чувствительности к лекарственным веществам 49
3.1.3. Идентификация генов-кандидатов в D.melanogaster и C.elegans 56
3.2. Идентификация человеческих ортологов найденных генов кандидатов 58
3.3 Влияние снижения экспрессии обнаруженных генов-кандидатов на чувствительность к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника 60
3.4. Характеристика молекулярных механизмов сенситизации к цисплатину: оценка индукции фокусов репарации и уровня фосфорилирования киназы ATR 66
3.4.1. Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на количества фокусов репарации повреждений ДНК, вызванных цисплатином 66
3.4.2. Влияние снижения экспрессии генов-кандидатов на уровень фосфорилирования киназы ATR - активатора фосфорилирования Н2АХ 70
3.5. Оценка роли потенциальных маркеров RAD50 и SMARCA5 в регуляции чувствительности к цисплатину и другим химиотерапевтическим препаратам в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника 72
3.6. Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на фосфорилирование гистонового белка H2AX в клетках опухоли головы и шеи и рака яичника .74
Глава 4. Обсуждение результатов .76
Выводы .82
Список сокращений 83
Список литературы 86
