Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Яд актиний содержит множество биологически активных пептидов 11
1.2 Пептиды Кунитц-типа – распространенные компоненты яда животных 13
1.3 Протеиназы – мишень пептидов Кунитц-типа большинства животных 16
1.4 Пептиды Кунитц-типа контролируют активность протеиназ 18
1.5 Ионные каналы – мишень токсинов Кунитц-типа ядовитых животных 22
1.5.1 Структура и функции Kv 22
1.5.2 Пептиды Кунитц-типа – блокаторы Kv1.x 24
1.5.3 Ионотропный рецептор TRPV1, структура и функции 27
1.5.4 Пептиды Кунитц-типа – антагонисты TRPV1 29
1.6 Пептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa 32
2 Материалы и методы 35
2.1 Материалы и оборудование 35
2.1.1 Материалы 35
2.1.2 Оборудование 36
2.1.3 Биологический материал 36
2.2 Методы 37
2.2.2 Протеомный анализ яда актинии Heteractis magnifica 37
2.2.3 Установление аминокислотной последовательности пептидов 39
2.2.4 Установление последовательностей транскриптов 40
2.2.5 Получение рекомбинантных пептидов 41
2.2.6 Установление биологической активности индивидуальных пептидов 46
3 Результаты исследования и их обсуждение 50
3.1 Протеомный анализ ядовитого секрета актинии H. magnifica 50
3.1.1 Получение нейротоксической фракции ядовитого секрета 50
3.1.2 Конструирование пептидных карт 52
3.1.3 Установление аминокислотных последовательностей пептидов 56
3.1.4 Установление последовательностей транскриптов, кодирующих пептиды Кунитц-типа актинии H. magnifica 58
3.2 Выделение новых пептидов Кунитц-типа из актинии H. crispa 60
3.3 Филогенетический анализ пептидов Кунитц-типа актиний H. crispa и H. magnifica 62
3.4 Получение рекомбинантных пептидов Кунитц-типа 65
3.5 Исследование биологической активности нативных и рекомбинантных пептидов 71
3.5.1 Определение трипсинингибирующей активности пептидов 71
3.5.2 Анализ острой токсичности пептидов 72
3.5.3 Электрофизиологический анализ пептидов 73
3.5.3.1 Пептиды HCRG1 и HCRG2 – блокаторы Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.6 и Shaker IR 73
3.5.3.2 Пептид HCRG21 – полный антагонист TRPV1 77
3.5.4 Противовоспалительная активность пептидов в моделях in vitro 79
3.5.4.1 Влияние пептидов на продукцию провоспалительных медиаторов 79
3.5.4.2 Влияние пептидов на развитие окислительного стресса 81
3.5.4.3 Антигистаминная активность пептидов 82
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы. 87
