Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Нейрональные стволовые клетки ЦНС взрослых млекопитающих 14
1.1.1. Стволовые клетки 15
1.1.2. Локализация и пути миграции НСК в головном мозге взрослых млекопитающих 16
1.1.3. НСК спинного мозга взрослых животных 18
1.2. Факторы и механизмы, регулирующие самообновление и дифференцировку НСК 18
1.2.1. Регуляция самообновления НСК 18
1.2.2. Участие MAPK сигнальных каскадов в регуляции пролиферации и дифференцировки НСК 21
1.2.3. Роль цитокинов в регуляции нейрогенеза 25
1.2.3.1.Семейство IL-6-подобных цитокинов 27
1.2.3.2. Нейротрофины 29
1.2.4. Роль р53 в нейрогенезе 31
1.2.4.1. Факты, определившие роль р53 в нейрональной дифференцировке 32
1.2.4.2. Роль р53 как транскрипционного фактора в регуляции дифференцировки 34
1.2.4.3. р53-зависимая регуляция клеточного цикла 36
1.2.4.4. Прямые белок-белковые взаимодействия р53 39
1.2.4.5. Влияние белка р53 на активность MAPK сигнального каскада 43
1.2.4.6. Посттрансляционные изменения белка р53 45
1.2.5. Протеинкиназы семейства Pim 48
1.2.5.1. Регуляция экспрессии, стабильности и активности Pim-1 49
1.2.5.2. Функциональная роль Pim киназ 51
1.2.5.3. Участие Pim-1 в регуляции апоптоза 52
1.2.5.4. Роль Pim-1 в регуляции клеточного цикла, пролиферации и дифференцировки 54
1.2.5.5. Роль Pim киназ в ЦНС 58
1.2.6. Белки семейства Bcl-2 60
1.2.6.1. Регуляция экспрессии Bcl-2 60
1.2.6.2. Регуляция активности Bcl-2 63
1.2.6.3. Роль Bcl-2 в регуляции клеточного цикла 64
1.2.6.4. Участие Bcl-2 в нейрональной дифференцировке 68
1.2.7. Функциональные взаимодействия между белками апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1 в соматических клетках 70
1.3. Трансплантация стволовых клеток 72
Глава 2. Результаты и обсуждение 77
2.1. Pim-1-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 77
2.1.1. Материалы и методы 78
2.1.1.1. Животные 78
2.1.1.2. Клеточные культуры 79
2.1.1.3. Использованные плазмиды для трансфекции клеток РС12 79
2.1.1.4. Эксперименты 80
2.1.1.5. Анализ люциферазной активности 81
2.1.1.6. In situ гибридизация 82
2.1.1.7. RT-PCR анализ экспрессии мРНК Pim-1 82
2.1.1.8. Анализ уровня катехоламинов 83
2.1.1.9. Вестерн блот анализ 83
2.1.1.10. Морфологический и иммуногистохимический анализ 83
2.1.1.10. Использованные антитела 84
2.1.1.11. Статистический анализ 84
2.1.2. Результаты 84
2.1.2.1. Анализ экспрессии Pim-1 в ЦНС крыс и мышей 84
2.1.2.2. Регуляция активности и экспрессии NFATc в дифференцированных клетках РС12 86
2.1.2.3. Pim-1 повышает активность NFATc в клетках РС12 88
2.1.2.4. Pim-1 повышает индуцированный форсколином синтез катехоламинов 90
2.1.2.5. Анализ NFATc2/c3 нокаутных мышей 92
2.1.2.6. Ингибирование Pim-1 изменяет направленность нейрональной дифференцировки 94
2.1.3. Обсуждение 98
2.2. Bcl-2-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 103
2.2.1 Материалы и методы 105
2.2.1.1. Животные 105
2.2.1.2. Органотипические культуры гиппокампа 105
2.2.1.3. Переживающие срезы гипоталамуса 105
2.2.1.4. Культуры нейрональных стволовых клеток 106
2.2.1.5. Эксперименты: 106
2.2.1.5. Иммуногистохимический анализ 108
2.2.1.6. Вестерн блот 108
2.2.1.7. Использованные антитела 108
2.2.1.8. Морфофункциональный анализ материала 109
2.2.1.9. Статистический анализ результатов. 109
2.2.2. Результаты 110
2.2.2.1. Анализ Bcl-2 нокаутных мышей 110
2.2.2.2. Эффекты ингибирования активности Bcl-2 на пролиферацию и дифференцировку НСК 111
2.2.2.3. Механизмы действия Bcl-2 115
2.2.3. Обсуждение 121
2.3. р53-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 124
2.3.1. Материалы и методы 127
2.3.1.1. Животные 127
2.3.1.2. Органотипические культуры гиппокампа 127
2.3.1.3. Переживающие срезы гипоталамуса 128
2.3.1.4. Клеточные культуры 128
2.3.1.5. Эксперименты: 129
2.3.1.6. Определение уровня дофамина 131
2.3.1.7. Морфологический, иммуногисто- и цитохимический анализ 132
2.3.1.8. Вестерн блот 132
2.3.1.9. Использованные антитела 132
2.3.1.9. Морфофункциональный анализ материала 133
2.3.1.10. Статистический анализ результатов. 133
2.3.2. Результаты 134
2.3.2.1. Влияние р53 на дифференцировку НСК 134
2.3.2.2. Анализ влияния р53 на функционирование катехоламинергических нейронов 139
2.3.2.3. Анализ ERK зависимого сигнального каскада 144
2.3.2.4. Анализ влияния р53 на механизмы самообновления НСК 151
2.3.3. Обсуждение 153
2.3.3.1. Влияние р53 на пролиферацию НСК и нейрональную дифференцировку 153
2.3.3.2. Анализ механизмов р53-зависимой нейрональной дифференцировки 158
2.4. Нейрогенный потенциал спинного мозга 163
2.4.1. Методы 164
2.4.1.1. Животные 164
2.4.1.2. Культуры спинного мозга 164
2.4.1.3. Культура клеток линии D3 165
2.4.1.4. Выявление алкалин-фосфатазы 165
2.4.1.5. ПЦР реакция с обратной транскрипцией 165
2.4.1.6. Дифференцировка клеток нейросфер 166
2.4.1.7. Использованные антитела для иммунофлуоресцентного анализа: 166
2.4.2. Результаты 166
2.4.2.1. Формирование нейросфер в органотипической культуре 166
2.4.2.2. Анализ нейросфер в органотипической культуре 168
2.4.2.3. Дифференцировка клеток нейросфер 169
2.4.3. Обсуждение 171
2.5. Трансплантация стволовых клеток в спинной мозг 174
2.5.1. Методы 178
2.5.1.1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток 178
2.5.1.2. Животные 179
2.5.1.3. Модель повреждения спинного мозга 179
2.5.1.4. Анализ поведения 181
2.5.1.5. Иммуноферментные анализы (ELISA) 182
2.5.1.6. Оценка фосфорилирования протеинкиназ 183
2.5.1.7. ПЦР в режиме реального времени 183
2.5.1.8. Вестерн блот анализ 185
2.5.1.9. Использованные антитела для Вестерн блот анализа, иммуноцитохимического- и гистохимического анализов 185
2.5.1.10. Статистический анализ 186
2.5.2. Результаты 186
2.5.2.1. Анализ нейрональной дифференцировки ЭСК 186
2.5.2.2. Анализ результатов поведенческих тестов 188
2.5.2.3. Морфологический анализ спинного мозга 193
2.5.2.4. Анализ экспрессии IL-6 и его рецепторов в спинном мозге и ЭСК 197
2.5.2.5. Анализ экспрессии BDNF и его рецепторов в спинном мозге и ЭСК 200
2.5.2.6. Трансплантированные клетки восстанавливают уровень цАМФ в ткани реципиента 202
2.5.2.7. Оценка белков, регулирующих рост аксонов 203
2.5.2.8. Оценка уровня глутамата в спинном мозге 204
2.5.2.9. Анализ экспрессии эритропоэтина в спинном мозге и ЭСК 206
2.5.2.10. Уровень фосфорилирования протеинкиназ 208
2.5.3. Обсуждение 209
Заключение 217
Выводы 220
Список литературы 221
