Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Лакказы и лакказо-подобные медьсодержащие оксидазы 14
1.1.1 Строение активного центра и механизм действия лакказ 16
1.1.2 Трехмерные структуры лакказ 17
1.2 Основные характеристики лакказ 18
1.2.1 Окислительно-восстановительный потенциал 19
1.2.2 Термо- и рН- зависимость активности лакказ 21
1.2.3 Каталитические константы 22
1.2.4 Гликозилирование 24
1.2.5 Субстратная специфичность лакказ 25
1.3 Разнообразие лакказ в природе и их физиологические роли 26
1.3.1 Физиологическая роль грибных лакказ 27
1.3.2 Мультигенные семейства грибных лакказ 29
1.4 Лакказы базидиомицетов рода Trametes 37
1.5 Системы экспрессии гетерологичных белков 42
1.5.1 Бактериальные системы экспрессии 42
1.5.2 Дрожжевые системы экспрессии 43
1.5.3 Грибные системы экспрессии 44
1.6 Практическое применение лакказ 48
1.7 Анализ рынка коммерческих препаратов лакказ 54
Глава 2. Материалы и методы 59
2.1 Реактивы и коммерческие наборы 59
2.2 Штаммы микроорганизмов 60
2.3 Среды и условия культивирования 60
2.3.1 Культивирование T. hirsuta 072 60
2.3.2 Культивирование P. canescens 61
2.3.3 Культивирование A. nidulans 62
2.3.4 Другие среды, использованные в работе 62
2.4 Создание продуцентов рекомбинантных изоферментов лакказ T. hirsuta 072 62
2.4.1 Конструирование плазмиды для трансформации в A. nidulans 62
2.4.2 Конструирование плазмид для трансформации в P. canescens 63
2.4.3 Трансформация E. coli 65
2.4.4 Трансформация P. canescens и A. nidulans 65
2.4.5 Выделение ДНК 66
2.4.6 Выделение РНК 66
2.4.7 Обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени 67
2.5 Определение внеклеточной протеолитической активности 68
2.6 Выделение и очистка рекомбинантных изоферментов 72
2.6.1 Определение концентрации белка 72
2.6.2 Электрофоретическое разделение белков 72
2.6.3 Определение активности изоферментов 73
2.7 Характристика рекомбинантных изоферментов 74
2.7.1 Оценка окислительно-восстановительного потенциала изоферментов лакказ 74
2.7.2 Определение каталитических параметров 74
2.7.3 Определение субстратной специфичности изоферментов 75
2.8 Оценка потенциала изоферментов к деградации красителей 75
2.9 Программное обеспечение для анализа данных 76
Глава 3. Результаты и их обсуждение 77
3.1 Выбор системы для экспрессии минорных рекомбинантных лакказ T. hirsuta 072 77
3.2 Создание продуцентов минорных лакказ 83
3.2.1 Клонирование генов лакказ и создание плазмидных конструкций 83
3.2.2 Трансформация P. canescens, анализ активности и уровня экспрессии целевых белков 87
3.3 Оптимизация условий культивирования трансформантов 91
3.3.1 Концентрация меди в среде 91
3.3.2 Продолжительность культивирования 92
3.3.3 рН среды 93
3.4 Поиск факторов, лимитирующих продукцию изоферментов лакказ 94
3.4.1 Динамика изменения рН в процессе культивирования 94
3.4.2 Протеолитическая активность 95
3.4.3 Изучение частоты использования кодонов для P. canescens. 98
3.5 Выделение и очистка минорных изоферментов лакказ T. hirsuta 072 101
3.6 Спектральный анализ изоферментов 104
3.7 Характеристика рекомбинантных минорных лакказ 106
3.7.1 Молекулярные свойства лакказ 106
3.7.2 Физико-химические свойства изоферментов 109
3.7.3 Окислительно-восстановительный потенциал минорных изоферментов 116
3.7.4 Каталитические свойства изоферментов 118
3.8 Оценка возможностей биотехнологического применения изоферментов лакказ 123
Заключение 129
Список цитируемой литературы 131
Благодарности 150
Приложения 151
