Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Промоторы 11
1.2 сг-субъединицы 17
1.3 Структура холофермента 21
1.4 Функции доменов а-субъединицы 26
1.4.1. Район 1 27
1.4.2. Район 2 29
1.4.3. Районы 2.5 и 3 30
1.4.4. Район 4 32
1.5 Детерминанты узнавания ДНК РНК-полимеразой 35
1.5.1. Матрицы с одноцепочечными поли-dC З-концами (tailed template).
35
1.6 Абортивная инициация 51
1.7 Путь от узнавания промотора до ухода в элонгацию - структурная модель 54
1.8 Диссоциация а-субъединицы 5S
1.9 Бесфакторная регуляция транскрипции 62
1.10 Влияние конформации ДНК на силу промотора 66
1.11 Взаимовлияние промоторов 67
2. Материалы и методы 70
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 70
2.2. Бактериальные среды 71
2.3. Электрофорез 71
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий 71
2.5 Конъюгация бактерий 72
2.6 Заражение клеток бактериофагом М13 72
2.6 Белки 73
2.8 Приготовление сг -субъединицы и фрагментов сг-субъединицы 73
2.9. Приготовление РНК-полимеразы из клеток 76
2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 78
2.11. Направленный ПЦР-мутагенез 78
2.12. Транскрипция in vitro 79
2.12.1. Транскрипция с laclJVS промотора 79
2.12.2. Транскрипция с Т7А1 промотора 81
2.12.3. Транскрипция на УНР М13 82
2.13 ДНК-белковая сшивка формальдегидом 84
2.14 Футпринтинг ДНКазой 1 85
2.15 Аффинное мечение РНКП 86
2.16 ДНК-белковая и белок-белковая сшивки в элонгационных комплексах.. 86
2.17 Расщепление РНК гидроксильными радикалами 87
2.18 Гель-фильтрация реакционных смесей после синтеза пРНК 88
3. Результаты и обсуждение 89
3.1 Изучение механизма воникновеиия паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUVS 89
3.1.1. Введение 89
3.1.2. Комплекс в состоянии паузы является элонгационным, сдвинутым назад (backtracked) 90
3.1.3. Г [ауза транскрипции в положении +17- явление, зависящее от сг -субъединицы 92
3.1.4. Пауза транскрипции в положении +17 возникает благодаря специфическому взаимодействию а -субъединицы с ДНК 92
3.1.5. Положение формальдегидной сшивки а70-субъедишщы на ДНК... 99
3.1.6. Последовательность района 2 о>субъединицы важна для образования паузы 101
3.1.6. Детерминанты взаимодействия а7 -субъединицы с корферментом в элонгационном комплексе 103
3.1.7. Заключение 106
3.2 Изучение роли <т -субъединицы в синтезе РНК-полимеразой Е.соН праймера для репликации генома бактериофага Ml3 110
3.2.1. Введение 110
3.2.2. Роль SSB в узнавании УНР 112
3.2.3. Предполагаемые -10 и -35 районы УНР не играют роли в узнавании 114
3.2.4. о -субъединица необходима для синтеза пРНК, но не нужна для узнавания УНР 116
3.2.5. ст7 -субъединица важна на стадии синтеза тринуклеотида 118
3.2.6. Роль района 3.2 о" -субъединицы в транскрипции пРНК 124
3.2.7. Функция в синтезе пРНК является общей для ст-факторов о"70-семейства 125
3.2.8. Место связывания шпильки УНР в корферменте 127
3.2.9. Заключение 129
3.3 Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага МЇЗ 132
3.3.1. Введение 132
3.3.2. После остановки синтеза РНК-полимераза продолжает быть связанной с РНК и ДНК, образуя необычный элонгационный комплекс- 132
3.3.3. Причина образования необычного элонгационного комплекса при синтезе пРНК 137
3.3.4. Расположение РНК-ДНК гибрида в РНК-полимеразе 147
3.3.5. Заключение 149
Выводы 151
Список сокращений 152
Список сокращений 152
Список литературы 153
Список опубликованных работ 177
