Введение
1. Обзор литературы
1.1 РНК полимераза
1.1.1 Строение РНК полимеразы
1.1.2 Особенности транскрипции РНК полимеразой
1.1.3 Строение промотора РНК полимеразы
1.1.4 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.2 РНК полимераза
1.2.1 Строение РНК полимеразы
1.2.2 Строение промотора РНК полимеразы
1.2.3 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.2.4 Терминация транскрипции РНК полимеразы
1.3 РНК полимераза
1.3.1 Строение промотора РНК полимеразы
1.3.2 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы
1.3.3. Терминация транскрипции РНК полимеразы
1.4 Митохондриальная РНК полимераза
1.4.1 Характеристика генома митохондрий
1.4.2 Строение митохондриальной РНК полимеразы
1.4.3 Промоторы митохондриальной РНК полимеразы и особенности ее транскрипции
1.4.4 Транскрипционный комплекс митохондриальной РНК полимеразы транскрипции
2. Материалы и методы
2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка 39
2.2. Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов 40
2.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорд 41
2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле 41
2.5. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция 41
2.6. Норзерн блот анализ 42
2.7. Приготовление проб для гибридизации на кДНК микроаррее 43
2.8. ОТ-ПЦР анализ 43
2.9. Выделение геномной ДНК из клеток эукариот 46
2.10. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 47
2.11. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 48
2.12. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами 49
2.13. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 49
2.14. Реакция лигирования 49
2.15. Получение конструктов и сиквенирование фрагментов к ДНК митохондриальной РНК полимеразы 50
2.16. Получение экслрессионньгх лентивирусных конструктов 51
2.17. Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий 54
2.18. Идентификация промоторов ALDH12 и ZBTB1, получение конструктов, содержащих изучаемые промоторы 55
2.19. Измерение активности люциферазы 59
2.20. Хроматиновая иммунопреципитация 60
2.21. Иммунофлуоресценция 62
3. Результаты и обсуждение
3.1. Обнаружение аномального поведения транскрипта гена PIG3 в ответ на обработку клеток а-аманитином, не характерного для генов, транскрибируемых РНК полимеразой II 64
3.2. Дополнительный транскрипт, размером 2.3 kb, является специфичным и кодируется геном PIG3 65
3.3. Идентификация и анализ транскриптов, которые подобно второму транскрипту гена PIG3, активируются в ответ на обработку а -аманитином 66
3.4. Характеристика транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 68
3.5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитину, возрастает после подавления РНК полимераз Ї или II 71
3.6. Экспрессия а-аманитин устойчивых генов снижается после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы 73
3.7. Белок, узнаваемый антителами к митохондриальной РНК полимеразе обнаруживается как в митохондриях, так и в ядре 78
3.8. Существование двух форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе 79
3.9. Доказательство существования альтернативного сплайсинга в гене митохондриальной РНК полимеразы 82
3.10. РНК полимераза IV кодируется альтернативной формой мРНК 84
3.11. Альтернативная форма РНК действительно способна кодировать ядерную форму белка ПО кД 86
3.12. Для трансляции белка РНК полимеразы IV используется шестой стартовый ATG кодон 88
3.13. Идентификация промоторов генов ALDH12, ZBTB и MGC3265 91
3.14. Характеристика промоторов генов ALDH12 и ZBTB1, демонстрирующих устойчивость к а -аманитину и транскрибируемых РНК полимеразой IV 93
3.15. Промоторы генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265, регулируемых РНК полимеразой IV, содержат общий структурно-функциональный мотив 95
3.16. Промоторы генов, регулируемых РНК полимеразой IV, не активируются энхансерами, стимулирующими транскрипцию РНК полимеразы II 96
3.17. РНК полимераза IV обладает способностью связываться с промотором гена ALDH12 97
3.18. Количественная оценка числа генов человека, транскрипция которых происходит с участием РНК полимеразы IV 99
Заключение 101
Выводы 102
