Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ
1.1.1. Общая характеристика молекул термолизин-подобных протеиназ 7
1.1.2. Организация активного центра 13
1.1.3. Организация субстрат-связывающего кармана 16
1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са"+ 19
1.2. Про-зависимый фолдинг термолизин-подобных протеиназ 24
1.3. Молекулярные основы стабилизации термолизин-подобных протеиназ 34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1. Микробные штаммы и плазмиды 49
2.2. Культивирование микроорганизмов 49
2.3. Выделение плазмидной ДНК 50
2.4. Выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а 50
2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот 51
2.6. Ферментативный гидролиз ДНК 51
2.7. Конструирование библиотеки генов Thermoactinomyces species 27а 51
2.8. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73 52
2.9. Трансформация клеток Escherichia coli TGI 52
2.10. Полимеразная цепная реакция 53
2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 53
2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральнои жидкости штаммов-продуцентов 53
2.13. Выделение рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 54
2.14. Электрофоретический анализ белков 55
2.15. Количественное определение белка 56
2.16. Определение молекулярной массы белка 56
2.17. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 56
2.18. Определение протеолитической активности ферментов 56
2.19. Влияние рН на стабильность фермента 57
2.20. рН-Оптимум протеолитической активности 57
2.21. Влияние температуры на стабильность фермента 57
2.22. Температурный оптимум протеолитической активности 57
2.23. Влияние ионов кальция на стабильность фермента 58
2.24. Влияние ингибиторов 58
2.25. Определение энзиматических констант фермента 58
2.26. Локализация лидерного пептида 58
2.27. Статистическая обработка данных 58
2.28. Представление молекул 59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 60
3.1. Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 60
3.2. Характеристика клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а, несущего ген металлопротеиназы 65
3.3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 66
3.4. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а....74
3.5. Характеристика рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а 77
ВЫВОДЫ -. 83
БЛАГОДАРНОСТИ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
