Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Рибонуклеазы различного происхождения и их биологические эффекты 13
1.2 Онконаза – РНКаза Rana pipiens с противоопухолевой активностью 15
1.3 -Сарцин – высокотоксичная РНКаза гриба 17
1.4 BS-РНКаза – природный димер 17
1.5 Барназа и ее применение в биотехнологии 18
1.6 Биназа – РНКаза c противоопухолевой и противовирусной активностью 1.6.1 Характеристика фермента 21
1.6.2 Биосинтез биназы
1.6.3 Противоопухолевые свойства биназы 26
1.6.4 Противовирусная активность биназы
1.7 Бальназа – РНКаза Bacillus altitudinis 29
1.8 Молекулярные детерминанты, определяющие цитотоксичность 31 РНКаз
1.9 Димеризация белков и ее роль в их биологической 38
активности
1.10 Димеризация рибонуклеаз 42
Экспериментальные исследования 46
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Штаммы бактерий 46
2.1.1. Условия культивирования бактерий 46
2.2 Выделение и очистка гомологичных РНКаз B. altitudinis и B. pumilus 46
2.2.1 Ионообменная хроматография на колонке с использованием ДЭАЭ- 46
целлюлозы КМ-32 и фосфоцеллюлозы Р-11
2.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 47
2.3 Рибонуклеазная активность з
2.4 Определение концентрации белков 49
2.5 SDS-электрофорез в ПААГ 49
2.5.1 Окрашивание гелей серебром 51
2.6 Определение РНКазной активности методом зимографии 51
2.7 Вестерн-блот 51
2.8 Масс-спектрометрический анализ 52
2.9 Нативный электрофорез
2.10 Гель-фильтрация 53
2.11 Оценка противоопухолевого потенциала ферментов 53
2.11.1 Клетки 53
2.11.2. Определение цитотоксичности РНКаз с использованием реагента 53 WST
2.12 Иммунопреципитация 54
2.13 Биоинформационный анализ 55
2.14 Статистическая обработка результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты исследований 57
3.1 Выделение и очистка внеклеточных РНКаз (биназы и бальназы) из 57
культуральной жидкости бацилл с использованием методов ионообменной хроматографии
3.1.1 Исследование динамики роста Bacillus altitudinis и биосинтеза бальназы
3.1.2 Идентификация и оценка гомогенности полученных белковых препаратов РНКаз методами масс-спектрометрического анализа
3.2 Исследование структурных особенностей гомологичных РНКаз 70
3.3 3D-моделирование молекул РНКаз и их димерных структур 77
3.4 Оценка цитотоксического потенциала полученных препаратов РНКаз: 80
биназы и бальназы
3.5 Белок-белковое взаимодействие биназы с ГТФазой K-Ras 81
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 84
4.1 Методы выделения и очистки гомологичных РНКаз из природных 84
штаммов-продуцентов
4.2 Структурная организация бальназы и биназы 87
4.2.1 Стабильность димерных структур 90
4.2.2 Моделирование структур димеров гомологичных РНКаз
4.3 Цитотоксичность РНКаз 92
4.4 Ингибирование MAPK/ERK сигнального пути биназой при связывании 94 с K-Ras
Заключение 98
Список сокращений и условных обозначений 101
Список литературы
