Введение
Глава 1. Целентеразин-зависимые люциферазы и их применение в качестве биолюминесцентных репортеров 11
1.1 Природа биологического свечения 11
1.2 Разнообразие целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем 13
1.3 Люциферазы морских копепод. Исследование ферментов и перспективы использования 18
1.4 Усовершенствованные и «искусственные» люциферазы, созданные на основе копеподных 26
1.5 Применение копеподных люцифераз для in vitro и in vivo визуализации 29
1.5.1 Иммунологические анализы 29
1.5.2 Комплементационные анализы для оценки белок-белковых взаимодействий 32
1.5.3 Проведение высокопоточных скринингов 36
1.5.4 Использование люцифераз в in vivo биоимиджинге 38
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1 Материалы 48
2.2 Буферные растворы и среды 49
2.3 Молекулярное клонирование 49
2.3.1 Получение конструкций для экспрессии изоформ люциферазы Metridia и Gaussia в клетках насекомых 49
2.3.2 Проведение олигонуклеотид-направленного мутагенеза 51
2.3.3 Получение конструкций для экспрессии бифункциональных гибридных белков 52
2.4 Получение вирусных стоков для бакуловирусной «Baco-Bac» экспрессии белков в клетках насекомых Sf9 54
2.5 Выделение и очистка белков из культуральной среды клеток Sf9 55
2.6 Определение биолюминесцентной активности люцифераз 56
2.7 Измерение спектров биолюминесценции и флуоресценции 57
2.8 Измерение спектрокинетики методом «остановленной струи» 57
2.9 Определение температуры плавления белков 58
2.10 Определение свободных тиольных групп 59
2.11 Экспрессия люциферазных изоформ в клетках HEK293 59
2.12 Модельный твердофазный биолюминесцентный иммуноанализ 60
2.13 Биолюминесцентный «сэндвич»-анализ с использованием природных клещевых экстрактов 61
2.14 Качественная и количественная оценка белковых препаратов 62
Глава 3. Получение изоформ рекомбинантных люцифераз Metridia longa в нативной форме из клеток насекомых 63
3.1 Сравнение последовательностей новых изоформ MLuc7 и MLuc2 64
3.2 Использование бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых для секреции рекомбинантных люцифераз 67
3.3 Очистка люцифераз из культуральной среды клеток Sf9 69
Глава 4. Физико-химические свойства новых изоформ MLuc7, MLuc2 люциферазы из M. longa и люциферазы из копеподы G. princeps 74
4.1 Свойства изоформы MLuc7 74
4.2 Получение новой психрофильной изоформы MLuc2 77
4.3 Получение люциферазы Gaussia, исследование свойств 81
Глава 5. Локализация аминокислот активного центра люциферазы MLuc7 86
Глава 6. Применение люциферазы MLuc7 как биолюминесцентного репортера in vivo и in vitro 94
6.1 Использование люциферазы MLuc7 как репортера в клетках млекопитающих 94
6.2 Использование MLuc7 как белка-партнера для создания гибридных аналитических систем 97
6.2.1 Получение генетических конструкций для экспрессии гибридных белков в клетках насекомых 97
6.2.2 Получение бифункциональных гибридных белков 99
6.2.3 Тестирование меток в модельном биолюминесцентном иммуноанализе 101
6.2.4 Проведение анализа на препаратах клещей 103
Заключение 105
Выводы 108
Список сокращений 110
Список цитируемой литературы 111
