Введение
1. Введение 4
1.1. Актуальность проблемы 4
1.2. Цели и задачи исследования 6
1.3. Научная новизна 7
1.4. Практическая и теоретическая значимость 8
1.5. Положения, выносимые на защиту 8
1.6. Апробация диссертации 9
1.7. Публикации по теме диссертации 9
1.8. Структура и объем диссертации 9
2. Обзор литературы 10
2.1. Формирование и строение яичника млекопитающих 10
2.2. Фолликулогенез 12
2.2.1. Строение фолликулов и их классификация 12
2.2.2. Гормональная регуляция фолликулогенеза 20
2.2.3. Взаимодействие между компонентами фолликула 23
2.3. Экспериментальные подходы к изучению фолликулогенеза млекопитающих 27
2.3.1. Способы сохранения фертильности 28
2.3.2. Культивирование в 2D условиях 31
2.3.3. Культивирование в 3D условиях 34
2.4. Лазерная микрохирургия клеток, ооцитов и эмбрионов 36
2.4.1. Мембранная хирургия 37
2.4.2. Фотопорация и трансфекция 38
2.5. Оптический пинцет. 39
2.5.1. Принципы работы оптического пинцета 40
2.5.2. Применение системы оптического манипулирования к единичным клеткам 42
2.5.4. Проблемы, сопутствующие применению оптического пинцета 46
2.6. Биопсия ооцитов и преимплантационных эмбрионов 47
3. Материалы и методы 50
3.1. Лабораторные животные 50
3.2. Получение биоматериала для эксперимента 50
3.2.1. Получение овариальной ткани и фолликулов 50
3.2.2. Получение преимплантационных эмбрионов 51
3.2.3. Выделение МСК КМ 51
3.3. Постановка экспериментов 52
3.3.1. Культивирование клеток и фолликулов 52
3.3.2. Сокультивирование фолликулов с клетками 53
3.3.3. Лазерная микрохирургия преимплантационных эмбрионов 54
3.4. Анализ данных, полученных при проведении экспериментов 59
3.4.1. Цитологический анализ 59
3.4.2. Анализ объектов методом электронной микроскопии 60
3.4.3. Молекулярно-биологический анализ образцов 62
3.4.4. Измерения и статистический анализ данных 65
4. Результаты и обсуждения 66
4.1. Подбор оптимальных условий для культивирования овариальных фолликулов in vitro 66
4.1.1. Культивирование овариальных фолликулов в 2D и 3D условиях 66
4.1.2. Культивирование овариальных фолликулов in vitro в 3D условиях в средах различного состава 72
4.2. Реконструкция соматического окружения первичного многослойного овариального фолликула мыши 76
4.2.1. Сокультивирование овариальных фолликулов со смешанной первичной культурой клеточных элементов стромы яичника мыши 77
4.2.2. Сокультивирование овариальных фолликулов с мезенхимными клетками стволовыми клетками, выделенными из костного мозга мыши 81
4.2.3. Молекулярно-биологическое исследование реконструированных фолликулов 86
4.3. Подбор параметров лазерного воздействия на преимплантационные эмбрионы мыши 97
4.3.1. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на цитоплазматическую мембрану клеток эмбриона 97
4.3.2. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на цитоплазму клеток эмбриона 103
4.3.3. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на оболочку эмбриона мыши 103
4.4. Биопсия редукционного тельца 106
4.5. Биопсия трофэктодермы 110
5. Заключение 114
6. Выводы 116
Список сокращений 117
7. Список литературы 119
