СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................................ 5
ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................................... 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................. 17
1.1 Рецепторы эпидермального фактора роста ErbB1–4:
EGFR/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4 ............................................................... 17
1.1.1 Лиганды рецепторов ErbB ................................................................................................... 18
1.1.2 Структура рецепторов ErbB ................................................................................................ 19
1.1.3 Механизм активации рецепторов ErbB .............................................................................. 21
1.2 Функции рецепторов ErbB и их роль в норме и патологии ................................................... 25
1.2.1 Функции рецепторов ErbB и их лигандов в норме ........................................................... 25
1.2.2 Рецепторы EGFR и HER2 как классические онкогены .................................................... 27
1.3 Проблема резистентности опухолей к блокированию HER2
и роль рецептора ErbB3 в ее формировании ................................................................................. 29
1.4 Фармакологическое блокирование рецепторов HER2 и ErbB3 ............................................. 31
1.4.1 Моноклональные антитела к рецептору HER2 ................................................................. 31
1.4.2 Моноклональные антитела к рецептору ErbB3 ................................................................. 33
1.4.3 Иммуноконъюгаты с цитотоксическими лекарствами ..................................................... 39
1.4.4 Альтернативные подходы для блокирования ErbB3 ........................................................ 41
1.5 Однодоменные антитела верблюдовых как альтернатива классическим IgG ..................... 43
1.5.1 Структура и свойства однодоменных антител .................................................................. 43
1.5.2 Использование технологий ДНК библиотек и фагового дисплея для отбора
однодоменных антител ................................................................................................................. 47
1.5.3 Системы для рекомбинантной экспрессии однодоменных антител ............................... 50
1.5.4 Области и форматы терапевтического применения однодоменных антител ................. 52
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ......................................................................................... 56
2.1 Материалы .................................................................................................................................. 56
2.1.1 Реагенты и расходные материалы ....................................................................................... 56
2.1.2 Штаммы бактерий и клеточные культуры ......................................................................... 57
2.2 Молекулярное клонирование и секвенирование ..................................................................... 58
2.2.1 Создание генетических конструкций ................................................................................. 58
2.2.2 Секвенирование и анализ данных ....................................................................................... 62
2.3 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков ...................................................................... 63
2.3.1 Бактериальная экспрессия однодоменных антител .......................................................... 63
2.3.2 Экспрессия фрагментов рецептора ErbB3 в клетках млекопитающих .......................... 65
2.4 Анализ структуры и стабильности однодоменных антител .................................................. 66
2.4.1 Анализ спектров кругового дихроизма .............................................................................. 66
3
2.4.2 Аналитическая гель-фильтрация ........................................................................................ 67
2.4.3 Определение дисульфидных связей методом Эллмана .................................................... 67
2.4.4 Анализ посттрансляционных модификаций при помощи масс-спектрометрии ............ 68
2.4.5 Получение кривых денатурации и анализ термодинамической стабильности .............. 69
2.5 Макромолекулярная кристаллография и моделирование ...................................................... 70
2.5.1 Поиск и оптимизация условий кристаллизации ................................................................ 70
2.5.2 Съемка и обработка рентгеновских данных ...................................................................... 70
2.5.3 Молекулярное моделирование комплексов антител с рецептором ErbB3 ..................... 71
2.6 Исследования связывания однодоменных антител с рецептором ......................................... 72
2.6.1 Изучение кинетики и аффинности связывания однодоменных антител с рецептором
методом поверхностного плазмонного резонанса ..................................................................... 72
2.6.2 Эпитопное картирование и изучение конкуренции с лигандом ...................................... 73
2.6.3 Флуоресцентная конфокальная микроскопия ................................................................... 73
2.7 Изучение антипролиферативной активности однодоменных антител ................................. 74
2.7.1 Тесты на антипролиферативную активность ..................................................................... 74
2.7.2 Проточная цитофлуориметрия ............................................................................................ 75
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................ 76
3.1 Совершенствование технологий отбора антител .................................................................... 76
3.1.1 Изучение ошибок и изменения клонального разнообразия при
амплификации сложных библиотек ДНК .................................................................................. 76
3.1.2 Теоретическая модель эффективности амплификации библиотеки ДНК,
инкапсулированной в капли эмульсии ........................................................................................ 80
3.2 Разработка системы гетерологической экспрессии однодоменных антител ....................... 85
3.2.1 Экспрессия в бактериях E. coli ΔtrxB Δgor cDsbC в виде химеры с белком SUMO
позволяет получать растворимые фолдированные однодоменные антитела
без молекулярных тагов ................................................................................................................ 85
3.2.2 Цитоплазматическая экспрессия имеет большую эффективность
чем классическая система периплазматической экспрессии .................................................... 90
3.3 Структурные и биохимические характеристики однодоменных антител ............................ 92
3.3.1 Исследованные однодоменные антитела находятся в мономерной форме
и обладают вторичной структурой, характерной для иммуноглобулинового домена ........... 92
3.3.2 Однодоменные антитела BCD090-P1 и BCD090-M2, но не BCD090-M456,
имеют каноническую дисульфидную связь ................................................................................ 96
3.3.3 Однодоменное антитело BCD090-P1 обладает уникальной
термодинамической стабильностью ............................................................................................ 99
3.4 Исследование пространственных структур высокого разрешения ..................................... 102
3.4.1 Изучение пространственных структур однодоменного антитела BCD090-M2
в различных кристаллических формах ..................................................................................... 102
3.4.2 Моделирование комплекса однодоменного антитела BCD090-M2
с эктодоменом рецептора ErbB3 ................................................................................................ 108
4
3.5 Взаимодействие однодоменных антител с рецептором ErbB3 ............................................ 110
3.5.1 Однодоменные антитела BCD090-P1 и BCD090-M2 связываются
с эктодоменом ErbB3 с высокой аффинностью ....................................................................... 110
3.5.2 BCD090-P1 и BCD090-M2 взаимодействуют с разными эпитопами ............................ 113
3.5.3 Однодоменные антитела связываются с рецептором на опухолевых клетках
и ко-локализуются с HER2 и ErbB3 ........................................................................................... 116
3.6 Антипролиферативное действие однодоменных антител .................................................... 119
3.6.1 Однодоменные антитела подавляют ErbB3-зависимую пролиферацию
клеток рака молочной железы MCF-7 ....................................................................................... 119
3.6.2 Однодоменные антитела подавляют ErbB3-зависимую пролиферацию
гиперэкспрессирующих рецептор HER2 клеток рака молочной железы SK-BR-3 .............. 122
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 126
ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................ 128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................................. 129
БЛАГОДАРНОСТИ ....................................................................................................................... 147
