Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Проблема межвидовой контаминации клеточных культур 13
1.2. Традиционные методы определения видовой принадлежности клеток в культуре 19
1.2.1. Изоферментный анализ клеточных культур 21
1.2.2. Кариологический анализ 25
1.2.2.1. Закономерности изменения кариотипа клеток длительно- культивируемых in vitro 27
1.3. Молекулярно-генетические методы видовой идентификации 32
1.3.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ)... 32
1.3.2. ПЦР с использованием произвольных праймеров 34
1.3.3. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов 36
1.3.4. ПЦР-ПДРФ анализ 37
1.3.5. Видоспецифичная ПЦР 39
1.3.6. Секвенирование маркерных последовательностей 43
Глава 2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы исследования 46
2.1.1 Материалы 46
2.1.1.1. Реактивы, препараты и оборудование 46
2.1.1.2. Клеточные культуры 47
2.1.1.3. Образцы тканей 49
2.2.1. Методы 49
2.2.1.1. Культивирование и криоконсервация клеточных культур 49
2.2.1.2. Кариологический анализ клеточных культур 51
2.2.1.2.1. Приготовление кариологических препаратов 51
2.2.1.2.2. Рутинная окраска препаратов 52
2.2.1.2.3. Окраска на G-полосы 52
2.2.1.2.4. Анализ хромосомных препаратов 53
2.2.1.3. Молекулярно-генетический анализ видовой принадлежности клеточных культур 54
2.2.1.3.1. Выделение ДНК 54
2.2.1.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участков мтДНК 57
2.2.1.3.3. Видоспецифичная ПНР 59
2.2.1.3.4. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле 61
Глава 3. Результаты исследований 62
3.1. Кариологический анализ клеточных культур 62
3.1.1. Клетки линии К562 промиелоцентарного лейкоза человека 63
3.1.2. Клетки почки кролика, линия RK-13 65
3.1.3. Соматический гибрид свиных клеток, линия А4ХС2 67
3.1.4. Соматический гибрид клеток свиньи и лошади, линия A4XL 70
3.1.5. Клетки кожи лошади, линия ЭКЛ 72
3.1.6. Клетки почки коровы, линия MDBK 75
3.1.7. Клетки легкого коровы, линия ЛЭК 77
3.1.8. Клетки почки собаки, линия MDCK 80
3.2. Оценка изменчивости и информативности участков генов cytb и COI в клеточных культурах 81
3.3. Разработка методики определения видовой принадлежности культур клеток на основе в ПЦР-РВ 85
3.3.1. Выбор диагностической мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и зондов 85
3.3.2. Первичная оценка сконструированных олигонуклеотидов и оптимизация условий проведения вП ЦР-РВ 91
3.3.3. Разработка и оптимизация мультиплексной вПЦР-РВ 93
3.3.3. Изучение чувствительности разработанной вПЦР-РВ 97
3.3.4. Изучение специфичности разработанной вПЦР-РВ 102
3.4. Видовая идентификация культур клеток с использованием вПЦР-РВ и анализа нуклеотидных последовательностей участков генов cytb и COL 105
Обсуждение результатов исследований 111
Выводы 125
Практические предложения 127
Список литературы 128
Приложение 150
