Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli 11
1.2. Создание штаммов-продуцентов интерферона альфа-2Ь на основе Escherichia coli и их ферментационное культивирование 31
1.3. Выделение и очистка интерферона альфа-2Ь 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы 41
2.2. Методы 42
2.2.1. Генноинженерные методики 42
2.2.2. Ферментационное культивирование в 2-х л ферментере 46
2.2.3. Ферментационное культивирование в 30-и л ферментере 46
2.2.4. Получение телец включения 47
2.2.5. Получение грубого экстракта интерферона 47
2.2.6. Очистка интерферона на катионите SP-Toyopearl 48
2.2.7. Очистка интерферона с использованием ОФ-ВЭЖХ 48
2.2.8. Аналитические методы 48
2.2.8.1. Измерение концентрации белка 48
2.2.8.2. Постановка белкового SDS электрофореза 49
2.2.8.3. ВЭЖХ 50
2.2.8.4. Метод молекулярной гибридизации на остаточную ДНК штамма-хозяина и вектора 51
2.2.8.5. Метод ИФА на остаточные белки штамма-продуцента...55
2.2.8.6. Метод биологического тестирования активности интерферона 60
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы 62
3.1.1. Создание вариантов гена человеческого альфа-F интерферона с различными заменами редко встречающихся кодонов и их клонирование в векторную плазмиду рЕТ22(Ь+) 62
3.1.2. Влияние тандема терминаторов транскрипции в 3- нетранслируемой области гена 66
3.2. Создание и ферментационное культивирование штамма- продуцента альфа-2Ь интерферона 70
3.2.1. Создание штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь70
3.2.2. Подбор условий культивирования на лабораторном 2-х л ферментере Multigen 72
3.2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном 30-и л ферментере Marubishi 77
3.3. Создание технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь 78
3.3.1. Получение грубого экстракта нативиого мономера интерферона 78
3.3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С 84
3.3.3. Хроматография на полу препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS 87
4. Заключение 92
5. Выводы 94
6. Список литературы 96
